Trang chủ

Trong các thí nghiệm sinh học phân tử và sinh học tế bào, chiết xuất protein hạt nhân có độ tinh khiết cao là bước quan trọng trong nghiên cứu các quá trình hạt nhân như điều hòa gen, hoạt động của yếu tố phiên mã và cấu trúc chromatin. Do sự khác biệt về phân bố giữa protein hạt nhân và protein tế bào chất, để đảm bảo độ chính xác của dữ liệu thực nghiệm, cần có phương pháp chiết xuất protein hạt nhân có ít ô nhiễm chéo và vận hành dễ dàng để thu được các mẫu protein hạt nhân có độ tinh khiết cao. Ngoài ra, protein hạt nhân rất nhạy cảm với môi trường bên ngoài và cần đặc biệt chú ý đến các điều kiện vận hành trong quá trình chiết xuất, chẳng hạn như kiểm soát nhiệt độ và sử dụng chất ức chế protease, để duy trì hoạt động của protein và tránh phân hủy.

Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất protein hạt nhân phù hợp cho các nhu cầu thử nghiệm khác nhau là đặc biệt quan trọng. Ví dụ, đối với các protein được biểu hiện nhiều trong nhân như HIF1-α và TWIST, nên sử dụng bộ dụng cụ chiết xuất protein hạt nhân hoặc đệm ly giải protein hạt nhân chuyên dụng để chiết xuất. Các phương pháp này không chỉ tối ưu hóa các bước vận hành mà còn giảm hiệu quả tình trạng nhiễm chéo giữa tế bào chất và protein hạt nhân, cung cấp cơ sở mẫu đáng tin cậy cho các thử nghiệm tiếp theo (như Western Blot, kết tủa miễn dịch, v.v.).

Sau đây là hai phương pháp chiết xuất protein hạt nhân tương đối dễ sử dụng:

Đối với các protein có biểu hiện cao trong nhân, chẳng hạn như HIF1-α và TWIST, nên sử dụng bộ dụng cụ chiết xuất protein hạt nhân đặc biệt hoặc đệm ly giải protein hạt nhân để chiết xuất.

Các bước chiết xuất protein hạt nhân (phương pháp nghiền đồng nhất)

Chuẩn bị

Trước khi tiến hành thí nghiệm chiết xuất protein hạt nhân, cần chuẩn bị trước các thuốc thử và đệm có liên quan để đảm bảo quá trình thí nghiệm diễn ra suôn sẻ. Sau đây là công thức chi tiết và cách sử dụng dung dịch thuốc nhuộm Trypan Blue và đệm:

Công thức dung dịch thuốc nhuộm Trypan Blue

Chuẩn bị dung dịch mẹ: Cân một lượng bột Trypan Blue thích hợp và hòa tan trong 10 mL nước cất hai lần để chuẩn bị dung dịch mẹ Trypan Blue 4% (w/v).

Pha loãng dung dịch làm việc: Sử dụng đệm PBS để pha loãng dung dịch mẹ 10 lần để thu được dung dịch làm việc có nồng độ 0,4%.

Cách sử dụng: Trộn dung dịch làm việc Trypan Blue 0,4% và huyền phù tế bào theo thể tích 1:1 để đếm tế bào hoặc phát hiện hoạt động của tế bào.

Công thức đệm A (đệm ly giải tế bào)

Thành phần:

10 mM HEPES (pH 7,9, 4°C)

1,5 mM MgCl₂

10 mM KCl

0,5 mM DTT (dithiothreitol)

Nếu bạn cần ngăn chặn sự phân hủy protein huyết tương ảnh hưởng đến protein hạt nhân, bạn có thể thêm 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)

Chức năng:

Được sử dụng để ly giải màng tế bào, giải phóng nhân tế bào và đảm bảo tính toàn vẹn của nhân tế bào.

Công thức đệm B (đệm chiết xuất protein hạt nhân)

Thành phần:

20 mM HEPES (pH 7,9)

25% (v/v) glycerol

0,42 M NaCl

1,5 mM MgCl₂

0,2 mM EDTA (axit ethylenediaminetetraacetic)

0,5 mM PMSF

0,5 mM DTT

Chức năng:

Phá vỡ màng nhân và giải phóng protein hạt nhân trong khi vẫn duy trì tính ổn định và hoạt động của protein.

Các bước chiết xuất protein hạt nhân

Thu thập tế bào

● Tiêu hóa các tế bào từ bình và thu thập chúng vào các ống nghiệm nhỏ.

● Ly tâm ở tốc độ 300 g trong 5 phút ở 4°C và loại bỏ phần dịch nổi.

● Rửa kết tủa tế bào 3 lần bằng đệm PBS để đảm bảo loại bỏ các tạp chất còn sót lại.

Chuẩn bị cho quá trình ly giải tế bào

● Sau khi ly tâm, loại bỏ phần dịch nổi. Thêm gấp 5 lần thể tích đệm A đã làm lạnh trước (ví dụ, thêm 100 μL đệm A cho mỗi 20 μL kết tủa tế bào), dùng pipet để trộn và huyền phù hoàn toàn các tế bào.

● Đặt huyền phù tế bào trên đá trong 10 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 300 g trong 5 phút ở 4°C.

Giải phóng nhân

● Sau khi ly tâm, loại bỏ phần dịch nổi, thêm gấp 25 lần thể tích đệm A đã làm lạnh trước một lần nữa và nhẹ nhàng dùng pipet để huyền phù lại các tế bào.

● Chuyển dịch huyền phù tế bào sang máy đồng nhất Dounce để đồng nhất hóa.

Theo dõi quá trình đồng nhất hóa

● Trong quá trình đồng nhất hóa, lấy một lượng nhỏ huyền phù tế bào và trộn với một thể tích bằng nhau là thuốc nhuộm xanh Trypan 0,4%.

● Quan sát màng tế bào bị vỡ dưới kính hiển vi:

● Nếu hầu hết các tế bào nhuộm màu xanh, điều đó có nghĩa là màng tế bào đã bị vỡ và dừng quá trình đồng nhất hóa.

● Nếu màng chưa bị vỡ hoàn toàn, hãy tiếp tục quá trình đồng nhất hóa.

Tách nhân tế bào và tế bào chất

● Khi hầu hết các tế bào bị vỡ, hãy chuyển huyền phù tế bào sang ống Eppendorf và ly tâm ở tốc độ 25.000 g trong 20 phút ở 4°C.

Kết quả ly tâm:

● Dịch nổi chứa các thành phần tế bào chất.

● Chất kết tủa là nhân tế bào, chứa protein hạt nhân.

Chiết xuất protein hạt nhân

●Thu thập kết tủa sau khi ly tâm, thêm 1 thể tích đệm B đã làm lạnh trước và thổi nhẹ để tái huyền phù kết tủa.

●Chuyển hỗn dịch vào máy đồng nhất mô sạch và đồng nhất 30 lần để đảm bảo protein hạt nhân được giải phóng hoàn toàn.

Hòa tan và chiết xuất protein

●Chuyển hỗn dịch đã đồng nhất vào ống Eppendorf và ủ trong máy lắc tốc độ thấp trên đá trong 45 phút để đảm bảo protein hạt nhân được hòa tan hoàn toàn.

●Ly tâm ở tốc độ 25.000 g trong 30 phút ở 4°C và thu thập phần dịch nổi, là protein hạt nhân đã tinh khiết.

Các bước chiết xuất protein hạt nhân (phương pháp bộ dụng cụ)

Chuẩn bị

Chuẩn bị thuốc thử

●Cân bằng bộ dụng cụ chiết xuất protein hạt nhân ở nhiệt độ phòng.

●Thêm PMSF vào thuốc thử chiết xuất protein huyết tương và thuốc thử chiết xuất protein hạt nhân đến nồng độ cuối cùng là 1 mM.

●Nếu mẫu chứa cysteine, thêm DTT vào cả hai thuốc thử đến nồng độ cuối cùng là 0,5 mM.

Thu thập và rửa tế bào

●Tiêu hóa tế bào từ thành bình và thu thập chúng trong ống Eppendorf.

●Ly tâm ở tốc độ 300 g trong 5 phút ở 4°C và loại bỏ phần dịch nổi.

●Rửa tế bào 1-2 lần bằng đệm PBS để loại bỏ tạp chất còn sót lại.

Phân hủy tế bào

● Ly tâm ở tốc độ 300 g trong 10 phút ở 4°C và loại bỏ phần dịch nổi.

● Thêm 5 thể tích thuốc thử chiết xuất protein huyết tương (ví dụ, thêm 100 μL cho mỗi viên tế bào 20 μL) và nhẹ nhàng trộn bằng cách đảo ngược để đảm bảo rằng các tế bào được phân tán đều. Cẩn thận tránh tạo xoáy để tránh phá vỡ tế bào quá mức.

Phản ứng phân hủy

● Đặt hỗn dịch tế bào trên đá trong 20 phút để phân hủy hoàn toàn các tế bào.

Tách protein tế bào chất

● Ly tâm ở tốc độ 250 g trong 20 phút ở 4°C và loại bỏ phần dịch nổi.

● Thêm 2 thể tích thuốc thử chiết xuất protein huyết tương đã làm lạnh trước vào viên tế bào và trộn nhẹ.

Giải phóng nhân

● Sử dụng ống tiêm có kim 0,14 mm để thổi nhẹ 5 lần để phân hủy hoàn toàn viên tế bào.

● Ly tâm ở tốc độ 10.000 g trong 30 phút ở 4°C, thu thập phần dịch nổi (protein tế bào chất) và loại bỏ phần cặn (protein nhân).

Chiết xuất protein nhân

●Thêm 50-100 μL thuốc thử chiết xuất protein nhân vào kết tủa protein nhân và thổi nhẹ 5 lần bằng ống tiêm kim có đường kính 0,14 mm để đảm bảo kết tủa được huyền phù hoàn toàn.

●Đặt huyền phù vào máy lắc tốc độ thấp trên đá và ủ trong 45 phút để thúc đẩy quá trình hòa tan protein nhân.

Tách nucleoprotein

●Ly tâm ở tốc độ 16.000 g trong 5 phút ở 4°C và thu thập phần dịch nổi, là protein nhân tế bào đã chiết xuất.

Các bước chiết xuất protein nhân mô

Chuẩn bị mẫu mô

●Cân mẫu mô cần chiết xuất.

●Cắt mô thành những mảnh nhỏ nhất có thể để tăng hiệu quả đồng nhất hóa.

Đồng nhất hóa mô

●Thêm 300-500 μL PBS cho mỗi 50 mg mô.

●Sử dụng máy đồng nhất hóa để đồng nhất hóa hoàn toàn trong điều kiện tắm nước đá để đảm bảo mô được phân tách hoàn toàn và tạo thành hỗn dịch đồng nhất.

Ly tâm và thu thập kết tủa

●Ly tâm ở tốc độ 500 g trong 3 phút ở 4°C và loại bỏ phần dịch nổi trong hỗn dịch mô.

●Thu thập kết tủa chứa tế bào và bào quan.

Chiết xuất nhân tế bào

●Thêm kết tủa thu được vào dung dịch chiết xuất protein huyết tương 200 μL.

●Tiếp tục chiết xuất protein nhân tế bào theo các bước ly tâm trên.

Việc lựa chọn phương pháp phù hợp nên được xác định dựa trên mục tiêu thử nghiệm, quy mô mẫu và thiết bị thử nghiệm. Trong các ứng dụng thực tế, các nhà nghiên cứu có thể linh hoạt lựa chọn phương pháp chiết xuất protein hạt nhân phù hợp dựa trên nhu cầu của riêng họ và các đặc điểm cụ thể của mẫu. Bất kể lựa chọn phương pháp nào, đảm bảo độ chính xác của thao tác và điều kiện nhiệt độ thấp là chìa khóa để thu được protein hạt nhân chất lượng cao.

Tôi hy vọng bài viết này có thể cung cấp tài liệu tham khảo có giá trị cho mọi người, giúp tối ưu hóa quá trình chiết xuất protein hạt nhân và nâng cao độ tin cậy cũng như khả năng lặp lại của thí nghiệm.