Trang chủ

ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme) là công nghệ xét nghiệm miễn dịch dựa trên sự liên kết đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể. Nguyên lý cơ bản của nó là cố định kháng nguyên hoặc kháng thể có nồng độ cụ thể trên bề mặt của microplate polystyrene bằng cách hấp phụ vật lý, sau đó thêm mẫu cần thử nghiệm và sử dụng mức độ phát triển màu do phản ứng giữa nhãn enzyme và chất nền tạo ra để phản ánh gián tiếp sự có mặt hoặc không có mặt hoặc lượng kháng nguyên hoặc kháng thể đang được thử nghiệm.

Là một loại công nghệ dán nhãn miễn dịch (bao gồm công nghệ miễn dịch huỳnh quang, công nghệ miễn dịch phóng xạ, công nghệ miễn dịch enzym và công nghệ vàng miễn dịch keo), công nghệ ELISA đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu khoa học và thí nghiệm lâm sàng do đặc tính phát hiện nhanh, nhạy, định tính hoặc định lượng.

ELISA là một trong những phương pháp thực nghiệm thường được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử, miễn dịch học và sinh học tế bào, nhưng trong quá trình vận hành thực tế, mọi người thường gặp phải nhiều khó khăn trong thực nghiệm. Ví dụ, trong các thí nghiệm ELISA, hiện tượng trống cao là một trong những vấn đề thường gặp, không chỉ ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả thực nghiệm mà còn có thể ảnh hưởng đến độ tin cậy của dữ liệu. Do đó, việc hiểu sâu sắc lý do gây ra hiện tượng trống cao và thực hiện các biện pháp tối ưu hóa hiệu quả là đặc biệt quan trọng.

Độ trống cao là sự gia tăng bất thường về giá trị hấp thụ của đối chứng âm tính hoặc mẫu trắng trong thí nghiệm ELISA. Thông thường, giá trị hấp thụ của giếng âm tính phải nhỏ hơn 0,1. Giá trị nền quá cao sẽ ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm, làm giảm độ chính xác và độ tin cậy của dữ liệu và khiến không thể đánh giá chính xác hàm lượng kháng nguyên hoặc kháng thể thực sự trong mẫu.

Các nguyên nhân phổ biến bao gồm:

● Đĩa không sạch

Giải pháp:

▼Rửa kỹ

Thời gian rửa không đủ sẽ gây ra dư lượng kháng thể, dẫn đến việc đổi màu của đối chứng âm tính.

Cố gắng kéo dài thời gian rửa, tăng số lần rửa và thêm một lượng chất hoạt động bề mặt thích hợp (như Tween-20, 0,05%) vào dung dịch rửa.

Khi rửa đĩa ở mỗi bước, hãy đảm bảo rửa kỹ và gõ nhẹ đĩa cho đến khi không còn chất lỏng còn sót lại rõ ràng trong giếng.

▼Tránh nhiễm chéo

Khi loại bỏ dung dịch rửa hoặc kháng thể ủ, hãy cẩn thận để tránh nhiễm chéo giữa các giếng.

Nên sử dụng đầu pipet một lần càng nhiều càng tốt để tránh nhiễm chéo do sử dụng nhiều lần.

Không nên tái sử dụng giấy lọc dùng khi gõ vào đĩa để tránh nhiễm chéo thứ cấp.

● Nồng độ kháng thể hoặc thuốc thử quá cao

Lý do: Nồng độ kháng thể, kháng thể thứ cấp gắn nhãn enzyme hoặc chất nền sinh màu quá cao, dẫn đến phản ứng không đặc hiệu tăng lên và tín hiệu nền tăng lên.

Giải pháp:

▼Tối ưu hóa nồng độ kháng thể: pha loãng kháng thể đến nồng độ làm việc phù hợp để tránh quá liều.

▼Kiểm soát nồng độ thuốc thử: điều chỉnh nghiêm ngặt nồng độ kháng thể thứ cấp gắn nhãn enzyme và chất nền sinh màu để tránh nồng độ quá mức.

▼Thực hiện thí nghiệm pha loãng gradient: pha loãng dần dần thông qua các thí nghiệm sơ bộ để xác định nồng độ tối ưu của từng thuốc thử và giảm nhiễu xóa.

● Chặn không hoàn toàn

Lý do: Dung dịch chặn (như BSA) có thể phản ứng chéo với kháng thể, dẫn đến tăng tín hiệu nền. Nếu nồng độ dung dịch chặn quá thấp hoặc thời gian chặn quá ngắn, quá trình chặn có thể không hoàn toàn, khiến kháng thể liên kết không đặc hiệu với đĩa ELISA, do đó làm tăng giá trị nền.

Giải pháp:

▼Sử dụng dung dịch chặn phù hợp và điều chỉnh nồng độ dung dịch chặn.

▼Thời gian chặn phải đủ, thường là 1-2 giờ (nhiệt độ phòng) hoặc qua đêm ở 4°C.

▼Đảm bảo rửa sạch các giếng đĩa sau khi chặn để loại bỏ dung dịch chặn dư thừa.

●Phản ứng màu quá dài

Lý do: Do tối ưu hóa hệ thống không đúng cách, phản ứng màu của mẫu yếu. Để bù đắp cho sự thiếu hụt này, thời gian phản ứng màu được kéo dài. Thời gian phản ứng màu dài dẫn đến tăng các phản ứng không đặc hiệu của chất nền.

Giải pháp:

▼Hệ thống phát hiện phải được tối ưu hóa và nồng độ của lớp phủ, kháng thể phát hiện và chất nền phải được điều chỉnh để đảm bảo các phản ứng nhạy và đặc hiệu.

▼Rút ngắn thời gian phản ứng màu, thường không quá 15 phút, để đảm bảo độ chính xác của kết quả thực nghiệm và tránh nhiễu xóa.

● Nhiễm bẩn hoặc suy thoái thuốc thử

Lý do: Nhiễm bẩn có thể xảy ra trong quá trình chuẩn bị hoặc lưu trữ thuốc thử và dung dịch đệm, dẫn đến tăng hiện tượng trắng.

Giải pháp:

▼ Sử dụng thuốc thử mới chuẩn bị để tránh nhiễm bẩn chéo.

▼ Sử dụng dung dịch đã lọc để đảm bảo độ tinh khiết của thuốc thử.

▼ Kiểm tra ngày hết hạn của kháng thể, chất nền, dung dịch rửa và dung dịch đệm để tránh sử dụng thuốc thử đã hỏng.

● Nhiệt độ và các yếu tố môi trường

Lý do: Nhiệt độ quá cao hoặc độ ẩm quá cao sẽ dẫn đến tăng cường các phản ứng không đặc hiệu, dẫn đến tăng hiện tượng trống mẫu

Giải pháp:

▼ Kiểm tra máy ủ để đảm bảo nhiệt độ ủ ổn định ở 37°C và ủ theo thời gian phản ứng trong hướng dẫn.

▼ Tránh để các giếng đĩa tiếp xúc với nhiệt độ cao hoặc ánh sáng mạnh trong thời gian dài.

Dụng cụ và thiết bị là cơ sở cho sự thành công của các thí nghiệm ELISA. Các thiết bị liên quan thường được sử dụng bao gồm pipet, máy đọc vi mạch, máy rửa vi mạch và máy ủ. Tất cả các thiết bị cần được kiểm tra và hiệu chuẩn thường xuyên để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy. Welso cung cấp các thiết bị chất lượng cao cần thiết cho nhiều thí nghiệm ELISA khác nhau. Vui lòng liên hệ với chúng tôi để biết thêm thông tin.