Trang chủ

Các tế bào có chức năng nuôi dưỡng được gọi là dưỡng bào, có nguồn gốc từ dưỡng bào bên ngoài phôi và là mắt xích quan trọng trong thai kỳ bình thường. Sau khi cấy phôi, dưỡng bào phân chia, đa sản và biệt hóa để tạo thành EVCT và tế bào nuôi dưỡng nhung mao (VCT) với các đặc điểm sinh học khác biệt rõ rệt.

Nguyên tắc cơ bản của việc phân lập và nuôi cấy tế bào nuôi dưỡng ngoài nhung mao ở người là EVCT có khả năng xâm lấn, tập hợp ở phần sâu của màng đệm tử cung để tạo thành các đảo và tiếp xúc gần nhất với các tế bào màng đệm tử cung, đây là một phần quan trọng của vi môi trường miễn dịch của mẹ và thai nhi.

Mô nhung mao được chọn từ màng rụng và được lọc bằng phương pháp tiêu hóa bằng enzym, sau đó nghiền và lọc, tiến hành ly tâm theo mật độ, lớp mật độ 40% được hấp thụ theo mật độ của tế bào để thu được tế bào nuôi dưỡng, và EVCT được tinh chế thêm bằng phương pháp nuôi cấy ngắn hạn tại các thời điểm khác nhau.

Theo hình thái, kiểu hình và đặc điểm chức năng của tế bào, các tế bào được xác định, phân lập và tinh chế bằng phương pháp miễn dịch mô hóa học hoặc kháng thể huỳnh quang, đồng thời gắn nhãn kháng nguyên bề mặt tế bào để phân loại bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào, tạo nền tảng cho thảo luận sâu hơn về chức năng sinh học của tế bào nuôi dưỡng.

Thuốc thử & Dụng cụ

Thuốc thử:

Dung dịch PBS, dung dịch D-Hanks, dịch ly giải RBC

Môi trường nuôi cấy DMEM/F12, huyết thanh bò thai nhi, trypsin

Collagenase loại IV, DNase loại I, Fibronectin (FN)

Collagen loại IV, Matrigel, dung dịch gốc Percoll, kháng sinh

Dụng cụ:

Kéo nhãn khoa, nhíp, lưới sàng các kích cỡ khác nhau (80 lưới, 300 lưới)

Các loại đĩa petri, tay cầm ống tiêm, ống ly tâm nhựa các thông số kỹ thuật khác nhau

Ống EP 1,5 ml, pipet, máy ly tâm lạnh tốc độ thấp để bàn Welso WLR600

Cột phân loại cực từ và hạt, tủ ấm CO2, máy lắc bồn nước, máy đếm tế bào dòng chảy

Quy trình thực nghiệm

Các bước cơ bản để phân lập và nuôi cấy tế bào nuôi dưỡng ngoại vi nhung mao ở người có thể được chia thành các bước sau:

1. Chuẩn bị thuốc thử

(1) Dung dịch collagen loại IV: hòa tan collagen loại IV với 0,25% axit axetic băng và hòa tan hoàn toàn ở 4 °C qua đêm, với nồng độ cuối cùng là 2,0 mg/ml. Khi sử dụng, đĩa được đóng gói ở mức 6~10 μg/c㎡ và qua đêm ở 4 °C. Đĩa nuôi cấy tế bào được phủ collagen loại IV có thể được khử trùng qua đêm bằng tia cực tím hoặc rửa sạch bằng etanol 75%.

(2) Dung dịch FN: hòa tan 1 mg bột khô FN trong 1 ml nước cất vô trùng, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để hòa tan tự nhiên và bảo quản ở nồng độ 1 mg/ml. Chia thành 20 μl/ống và bảo quản ở -70 °C.

(3) Hòa tan 20 μl dung dịch FN vào 1 ml môi trường FD (nồng độ 20 μg/ml), đổ vào đĩa Petri đường kính 35 mm, ủ ở nhiệt độ phòng trong 45 phút và loại bỏ môi trường.

Ghi chú:

Đĩa Petri được phủ ngay có thể sử dụng hoặc bảo quản ở nhiệt độ -20 °C, nhưng không quá 2 tuần.

2. Mô màng đệm tươi được rửa ba lần bằng PBS 1x để loại bỏ cục máu đông và màng thai nhi, và mô nhung mao được lấy và cắt thành 3 mảnh có kích thước 1 mm bằng kéo cắt mắt.

3. Thêm 0,25% trypsin và 0,1% DNase I, tiêu hóa trong bồn nước ở 37 °C với lắc nhẹ trong 5 phút, sau đó hút dịch tiêu hóa và loại bỏ.

4. Phần mô còn lại được tiêu hóa bằng 0,25% trypsin và 0,1% DNase I trong bồn nước ở 37 °C trong 10 phút, quá trình tiêu hóa được hút ra và thêm 10% huyết thanh bê để kết thúc quá trình tiêu hóa. Lặp lại điều này trong 3~4 lần và thu thập toàn bộ phần dịch nổi.

5. Phần dịch nổi đã tiêu hóa giàu tế bào nuôi dưỡng được lọc qua lưới lọc 80 và lưới lọc 300, thu thập chất lỏng đã lọc, ly tâm ở tốc độ 300 g trong 10 phút và loại bỏ phần dịch nổi.

6. Các viên tế bào được tái huyền phù và mạ trên một gradient Percoll không liên tục (10%~70%, một gradient trên 10%) và ly tâm ở 1000 g trong 20 phút.

7. Hấp thụ tế bào với lớp mật độ 40% (p = 1,048 ~ 1,062 g / ml) dưới dạng tế bào nuôi dưỡng và thêm môi trường nuôi cấy DMEM có hàm lượng glucose cao chứa 10% huyết thanh bò sau khi rửa.

8. Điều chỉnh mật độ tế bào thành 5x10/ml, cấy vào đĩa phủ collagen loại IV (hoặc FN hoặc Matrigel) đã tráng sẵn và ủ bám dính trong 10 phút để loại bỏ các nguyên bào sợi dễ bám dính. Ủ trong tủ ấm 37 °C, 5% CO2 trong 24 giờ trước khi thay đổi môi trường nuôi cấy lần đầu tiên.

9. Sau 24 giờ, trạng thái tăng trưởng của tế bào được quan sát dưới kính hiển vi tương phản pha đảo ngược. EVCT có thể di chuyển và kết tụ, nhưng không hợp nhất và khả năng tăng sinh yếu.

10. Xác định miễn dịch mô học các tế bào thu được dựa trên đặc điểm âm tính với vimentin, dương tính với CK7.

11. Sau khi được gắn nhãn bằng kháng thể bề mặt kháng HLA-G, FACSAriaII đã phân loại và tinh chế các tế bào nuôi dưỡng ngoài nhung mao HLA-G+ với độ tinh khiết >95%.

Lưu ý

●Mô nhung mao có thể được tiêu hóa bằng 1 mg/ml collagenase IV và 0,1 mg/ml DNase I tùy thuộc vào điều kiện phòng thí nghiệm.

●EVCT có khả năng tăng sinh yếu và quá nhiều lần truyền có thể dễ dàng gây mất một số đặc điểm sinh học của tế bào, do đó, điều quan trọng là phải giảm số lần truyền trong các tế bào nuôi cấy.

●EVCT và VCT đều biểu hiện CK7 và không biểu hiện vimentin, và có thể được xác định bằng phương pháp miễn dịch mô hóa học c-erbB-2 để phân biệt giữa EVCT (dương tính với c-erbB-2) và VCT (âm tính với c-erbB-2).