Blog

Makrofajlar vücudun bağışıklık sisteminde kritik öneme sahiptir, patojenleri fagosite etmede, bağışıklık tepkilerini düzenlemede ve doku homeostazını korumada önemli bir rol oynar. Birincil çıkarma yöntemi sayesinde araştırmacılar, hücre hatlarının birden fazla geçişinin neden olabileceği genetik değişimleri ve işlevsel gerilemeyi önleyebilir ve canlı organizmalardan tam biyolojik aktiviteye sahip makrofajları doğrudan elde edebilir ve bu da sonraki deneyler için sağlam bir temel oluşturur.

Birincil kemik iliğinden türetilen makrofajlar uyarılmadıklarında genellikle yuvarlak veya ovaldir, hücre boyutları değişkendir, küçük çekirdekler, çoğunlukla yuvarlak veya oval, gevşek kromatin ve belirgin nükleoller vardır. Vakuoller ve granüler maddeler sitoplazmada yaygındır ve bu yapılar fagositik işlevleriyle yakından ilişkilidir.

Santrifüjler BMDM hücre çıkarma sürecinde hayati bir rol oynar. Santrifüjleme adımıyla, hücreleri etkili bir şekilde ayırıp çökelterek yüksek kaliteli kemik iliği makrofajları elde edebiliriz. Santrifüjleme süreci yalnızca safsızlıkları gidermeye yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda çıkarma sürecinde vazgeçilmez bir anahtar bağlantı olan hücrelerin saflığını ve aktivitesini de sağlar.

Aşağıda fareleri örnek olarak kullanarak birincil makrofaj çıkarma yöntemi için ayrıntılı adımlar ve önlemler verilmiştir:

Deneysel materyal hazırlama

Deney hayvanları: C57BL/J fareleri

Reaktifler: FBS, %75 etanol ve steril PBS içeren DMEM yüksek glikozlu kültür ortamı.

Deneysel ekipman: tek kullanımlık şırıngalar, cerrahi aletler, santrifüj tüpleri, santrifüjler, hücre kültürü plakaları veya kültür şişeleri, vb.

Deneysel adımlar

●Anestezi ve öldürme: Fareler anestezi altına alındıktan sonra, hayvan deneylerinin etiğine uygun olarak ve farelerin acısını en aza indirerek, dislokasyon yoluyla hızlı ve insani bir şekilde öldürüldüler.

●Yüzey dezenfeksiyonu: Fareleri 5 dakika boyunca %75 etanol içeren bir behere batırın. İyice dezenfekte ettikten sonra, fazla alkolü emmek için temiz bir kağıt havlu kullanın.

●Deri ve eklem tedavisi: Farenin sırtında küçük bir kesi yapmak için steril makas kullanın, deriyi çıplak elle baldır eklemine kadar yırtın ve ayak eklemini ve deriyi çıkarın.

●Bacak örneklemesi ve ikincil dezenfeksiyon: Kırıkları önlemek için steril makas kullanarak arka bacakları uyluğun kökündeki büyük trokanterden dikkatlice ayırın. Kasları çıkardıktan sonra, bacak kemiklerini 5 dakika boyunca %75 etanol içeren bir kültür kabına batırın. ●5 dakika sonra bacak kemiklerini etanol kültür kabından çıkarın, yeni bir etanol kültür kabına koyun ve sonraki deneyler için steril bir ortam sağlamak amacıyla temiz tezgaha alın.

BMDM hücre ekstraksiyonu ve indüksiyonu

● Bacak kemiği ön işlemi: Etanolle ıslatılmış fare bacak kemiklerini soğuk PBS ile dolu bir kaba aktarın, etanolü tamamen daldırın ve kemik yüzeyindeki PBS ile durulayın, iyice temizlendiğinden emin olmak için 3 kez tekrarlayın.

● Kemik iliği ekstraksiyonu: Temizlenmiş femur ve tibiayı ayırın ve her iki ucunu da sterilize edilmiş makasla kesin. Soğuk indüksiyon ortamını emmek için 1 mL'lik bir şırınga kullanın, kemik ucuna nişan alın ve kemik iliğini üfleyin ve bacak kemiğinde belirgin kırmızı kemik iliği kalıntısı kalmayana kadar yaklaşık 3 kez tekrar tekrar üfleyin ve yıkayın.

● Hücre dağılımı ve filtrasyonu: Hücre kümelerini dağıtmak için kemik iliği hücrelerini içeren ortamı nazikçe üflemek için 5 mL'lik bir pipet kullanın. Kirlilikleri gidermek için süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre filtresinden süzün ve süzüntüyü 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. ● Santrifüjleme ve yeniden süspansiyon: 1500 rpm'de 5 dakika santrifüj edin ve üstteki sıvıyı atın. Hücreleri yeniden süspansiyon haline getirmek için kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin, 5 dakika bekletin ve ardından aynı hızda 5 dakika santrifüjleyin ve üstteki sıvıyı atın. Son olarak, hücre peletini soğuk indüksiyon ortamıyla yeniden süspansiyon haline getirin.

● Hücre kültürü ve ortam değişimi: Hücreleri gerektiği gibi plakalayın. Üçüncü gün, kültür ortamının yarısı, stabil bir kültür ortamı sağlamak için değiştirildi; beşinci gün, hücre büyümesi ve farklılaşmasının ihtiyaçlarını karşılamak için tam miktarda taze kültür ortamı değiştirildi; yedinci gün, hücreler kullanılabilir bir duruma ulaştı.

Notlar

●BMDM hücreleri pasajlanamaz: BMDM hücrelerinin özel biyolojik özellikleri nedeniyle, pasaj işlemleri için uygun değildirler.

●Tripsin sindiriminden kaçının: Tripsin genellikle yapışık hücreleri ayırmak için kullanılır, ancak BMDM hücreleri için uygun değildir. Tripsinin proteolitik aktivitesi hücre zarını ve anahtar proteinleri yok ederek hücre inaktivasyonuna ve sonraki deneyler için kullanılamaz hale getirir. Bu nedenle, BMDM hücrelerini tedavi etmek için tripsin kullanmayın.

●Hücre kazıyıcı kullanılması önerilir: Pasaj ve tripsin sindiriminin sınırlamaları nedeniyle, BMDM hücrelerini nazikçe kazımak için hücre kazıyıcı kullanılması önerilir.

●Kültür kaplarının sık sık değiştirilmesinden kaçının: BMDM hücreleri kırılgandır ve çevreye karşı hassastır. Elde edildikten sonra deneyler için doğrudan plakalanması önerilir. Kültür kaplarının sık sık değiştirilmesi fiziksel bozulmalara neden olabilir, hücre çarpışmalarına ve çekilmelerine neden olabilir, böylece hücrelere zarar verebilir ve deneysel sonuçları etkileyebilir.

Yukarıda, kullanıcılar için faydalı olacak BMDM hücre ekstraksiyonunun ayrıntılı süreci gösterilmektedir. Biyolojik deneylerde, Welso size ihtiyacınız olan tüm deneysel aletleri sağlayabilir. Santrifüj serimizin deneyde vazgeçilmez bir yardımcı olduğunu özellikle belirtmekte fayda var. Düşük hızlı santrifüjler, yüksek hızlı santrifüjler, soğutmalı santrifüjler, mini santrifüjler ve büyük kapasiteli zemin santrifüjleri dahil olmak üzere küresel müşterilere yüksek kaliteli santrifüj ürünleri sağlamaya odaklanıyoruz. Ürünlerimizle ilgileniyorsanız, lütfen zamanında bizimle iletişime geçin ve en iyi teklifi alacaksınız.