Blog

Moleküler biyoloji ve hücre biyolojisi deneylerinde, nükleer proteinlerin yüksek saflıkta çıkarılması, gen regülasyonu, transkripsiyon faktörü aktivitesi ve kromatin yapısı gibi nükleer süreçlerin incelenmesinde önemli bir adımdır. Nükleer proteinler ile sitoplazmik proteinler arasındaki dağılım farkından dolayı, deneysel veri doğruluğunu sağlamak için, yüksek saflıkta nükleer protein örnekleri elde etmek için düşük çapraz kontaminasyon ve kolay kullanım sağlayan bir nükleer protein çıkarma yöntemi gereklidir. Ayrıca, nükleer proteinler dış ortama karşı hassastır ve protein aktivitesini korumak ve bozunmayı önlemek için çıkarma işlemi sırasında sıcaklık kontrolü ve proteaz inhibitörlerinin kullanımı gibi çalışma koşullarına özel dikkat gösterilmelidir.

Farklı deneysel ihtiyaçlar için uygun nükleer protein çıkarma yöntemini seçmek özellikle önemlidir. Örneğin, HIF1-α ve TWIST gibi çekirdekte yüksek oranda ifade edilen proteinler için, çıkarma için bir nükleer protein çıkarma kiti veya özel bir nükleer protein lizis tamponu kullanılması önerilir. Bu yöntemler yalnızca işlem adımlarını optimize etmekle kalmaz, aynı zamanda sitoplazma ve nükleer proteinler arasındaki çapraz kontaminasyonu da etkili bir şekilde azaltarak sonraki deneyler (Western Blot, immünoçöktürme vb. gibi) için güvenilir bir örnek temeli sağlar.

İşte kullanımı nispeten kolay iki nükleer protein çıkarma yöntemi:

HIF1-α ve TWIST gibi çekirdekte yüksek ekspresyona sahip proteinler için, çıkarma için özel bir nükleer protein çıkarma kiti veya nükleer protein lizis tamponu kullanılmalıdır.

Nükleer protein çıkarma adımları (homojenizasyon öğütme yöntemi)

Hazırlık

Nükleer protein çıkarma deneyinden önce, deneysel sürecin sorunsuz ilerlemesini sağlamak için ilgili reaktifler ve tamponlar önceden hazırlanmalıdır. Aşağıda Trypan Mavisi boya çözeltisi ve tamponunun ayrıntılı formülü ve kullanımı verilmiştir:

Trypan Mavisi boya çözeltisi formülü

Ana çözeltinin hazırlanması: Uygun miktarda Trypan Mavisi tozunu tartın ve 10 mL çift damıtılmış suda eriterek %4 (w/v) Trypan mavisi ana çözeltisi hazırlayın.

Çalışma çözeltisi seyreltmesi: Ana çözeltiyi 10 kat seyreltmek için PBS tamponu kullanın ve %0,4 konsantrasyonlu çalışma çözeltisi elde edin.

Kullanım: Hücre sayımı veya hücre aktivitesi tespiti için %0,4 Trypan mavisi çalışma çözeltisini ve hücre süspansiyonunu 1:1 hacimde karıştırın. Tampon A formülü (hücre lizis tamponu)

İçindekiler:

10 mM HEPES (pH 7,9, 4°C)

1,5 mM MgCl₂

10 mM KCl

0,5 mM DTT (ditiyotreitol)

Plazma proteinlerinin bozunmasının nükleer proteinleri etkilemesini önlemeniz gerekiyorsa, 1 mM PMSF (fenilmetilsülfonil florür) ekleyebilirsiniz

İşlev:

Hücre zarı lizi, hücre çekirdeklerinin serbest bırakılması ve hücre çekirdeğinin bütünlüğünün sağlanması için kullanılır. Tampon B formülü (nükleer protein çıkarma tamponu)

İçindekiler:

20 mM HEPES (pH 7,9)

%25 (h/h) gliserol

0,42 M NaCl

1,5 mM MgCl₂

0,2 mM EDTA (etilendiamintetraasetik asit)

0,5 mM PMSF

0,5 mM DTT

İşlev:

Nükleer zarı yırtın ve proteinlerin stabilitesini ve aktivitesini korurken nükleer proteinleri serbest bırakın.

Nükleer protein çıkarma adımları

Hücre toplama

● Hücreleri şişeden sindirin ve mikro tüplere toplayın.

● 4°C'de 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj edin ve üstteki sıvıyı atın.

● Kalan safsızlıkların giderildiğinden emin olmak için hücre çökeltisini 3 kez PBS tamponuyla yıkayın.

Hücre lizisi için hazırlık

● Santrifüjlemeden sonra üstteki sıvıyı atın. Önceden soğutulmuş Tampon A'nın hacminin 5 katını ekleyin (örneğin, her 20 μL hücre çökeltisi için 100 μL Tampon A ekleyin), karıştırmak için pipetleyin ve hücreleri tamamen süspanse edin.

● Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca buz üzerine koyun, ardından 4°C'de 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj edin. Çekirdek salınımı

● Santrifüjlemeden sonra, üstteki sıvıyı atın, önceden soğutulmuş Tampon A'nın hacminin 25 katını tekrar ekleyin ve hücreleri yeniden süspansiyon haline getirmek için nazikçe pipetleyin.

● Hücre süspansiyonunu homojenizasyon için bir Dounce homojenizatörüne aktarın.

Homojenizasyon izleme

● Homojenizasyon işlemi sırasında, az miktarda hücre süspansiyonu alın ve eşit hacimde %0,4 Trypan mavi boya ile karıştırın.

● Hücre zarının yırtılmasını mikroskop altında gözlemleyin:

● Hücrelerin çoğu maviye boyanmışsa, hücre zarının yırtıldığı anlamına gelir ve homojenizasyonu durdurun.

● Tamamen yırtılmamışsa, homojenizasyona devam edin.

Hücre çekirdeği ve sitoplazmanın ayrılması

● Hücrelerin çoğu yırtıldığında, hücre süspansiyonunu bir Eppendorf tüpüne aktarın ve 4°C'de 20 dakika boyunca 25.000 g'de santrifüjleyin. Santrifüj sonuçları:

●Üst sıvı sitoplazmik bileşenler içerir.

●Çökelti, nükleer protein içeren hücre çekirdeğidir.

Nükleer protein ekstraksiyonu

●Santrifüjlemeden sonra çökeltiyi toplayın, 1 hacim önceden soğutulmuş Tampon B ekleyin ve çökeltiyi yeniden süspansiyon haline getirmek için hafifçe üfleyin.

●Süspansiyonu temiz bir doku homojenizatörüne aktarın ve nükleer proteinin tamamen serbest kaldığından emin olmak için 30 kez homojenize edin.

Protein çözünmesi ve ekstraksiyonu

●Homojenize edilmiş süspansiyonu bir Eppendorf tüpüne aktarın ve nükleer proteinin tamamen çözündüğünden emin olmak için 45 dakika boyunca buz üzerinde düşük hızlı bir çalkalayıcıda inkübe edin.

●4°C'de 30 dakika boyunca 25.000 g'de santrifüjleyin ve saflaştırılmış nükleer protein olan üst sıvıyı toplayın.

Nükleer protein çıkarma adımları (kit yöntemi)

Hazırlık

Reaktif hazırlama

●Nükleer protein çıkarma kitini oda sıcaklığına getirin.

●Plazma protein çıkarma reaktifine ve nükleer protein çıkarma reaktifine 1 mM'lik son konsantrasyona kadar PMSF ekleyin.

●Numune sistein içeriyorsa, her iki reaktife de 0,5 mM'lik son konsantrasyona kadar DTT ekleyin.

Hücre toplama ve yıkama

●Hücreleri şişe duvarından sindirin ve bir Eppendorf tüpüne toplayın.

●4°C'de 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj edin ve üstteki sıvıyı atın.

●Kalan safsızlıkları gidermek için hücreleri 1-2 kez PBS tamponuyla yıkayın.

Hücre lizi

● 4°C'de 10 dakika boyunca 300 g'de santrifüj edin ve üstteki sıvıyı atın.

● 5 hacim plazma proteini çıkarma reaktifi ekleyin (örneğin, 20 μL hücre peleti başına 100 μL ekleyin) ve hücrelerin eşit şekilde süspanse edildiğinden emin olmak için ters çevirerek hafifçe karıştırın. Aşırı hücre bozulmasını önlemek için girdaplamadan kaçınmaya dikkat edin.

Lizis reaksiyonu

● Hücreleri tamamen lize etmek için hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca buz üzerine koyun.

Sitoplazmik protein ayırma

● 4°C'de 20 dakika boyunca 250 g'de santrifüj edin ve üstteki sıvıyı atın.

● Hücre peletine 2 hacim önceden soğutulmuş plazma proteini çıkarma reaktifi ekleyin ve hafifçe karıştırın.

Nükleer salınım

● Hücre peletini tamamen lize etmek için 0,14 mm iğneli bir şırınga kullanarak 5 kez hafifçe üfleyin. ● 4°C'de 30 dakika boyunca 10.000 g'de santrifüj edin, üstteki sıvıyı (sitoplazmik protein) toplayın ve peleti (nükleer protein) atın.

Nükleer protein ekstraksiyonu

● Nükleer protein çökeltisine 50-100 μL nükleer protein ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve çökeltinin tamamen süspanse olduğundan emin olmak için 0,14 mm çapında bir iğne şırıngayla 5 kez hafifçe üfleyin.

● Süspansiyonu buz üzerinde düşük hızlı bir çalkalayıcıya yerleştirin ve nükleer proteinin çözünmesini desteklemek için 45 dakika inkübe edin.

Nükleoprotein ayrımı

● 4°C'de 5 dakika boyunca 16.000 g'de santrifüj edin ve üstteki sıvıyı, yani çıkarılan hücre nükleer proteinini toplayın.

Doku nükleer proteini çıkarma adımları

Doku örneği hazırlama

●Çıkartılacak doku örneğini tartın.

●Homojenizasyon verimliliğini artırmak için dokuyu mümkün olduğunca küçük parçalara kesin.

Doku homojenizasyonu

●Her 50 mg doku için 300-500 μL PBS ekleyin.

●Dokunun tamamen ayrıştığından ve düzgün bir süspansiyon oluşturduğundan emin olmak için buz banyosu koşulları altında tamamen homojenleştirmek için bir homojenizatör kullanın.

Santrifüjleme ve çökelti toplama

●4°C'de 3 dakika boyunca 500 g'de santrifüjleyin ve doku süspansiyonundaki üst sıvıyı atın.

●Hücreleri ve organelleri içeren çökeltiyi toplayın.

Hücre nükleer ekstraksiyonu

●Toplanan çökeltiyi 200 μL plazma proteini çıkarma solüsyonuna ekleyin.

●Yukarıdaki santrifüjleme adımlarına göre hücre nükleer proteinini çıkarmaya devam edin.

Uygun bir yöntemin seçimi deneysel hedeflere, örnek büyüklüğüne ve deneysel ekipmana göre belirlenmelidir. Pratik uygulamalarda, araştırmacılar kendi ihtiyaçlarına ve örneğin belirli özelliklerine göre esnek bir şekilde uygun bir nükleer protein çıkarma yöntemi seçebilirler. Hangi yöntemi seçerseniz seçin, yüksek kaliteli nükleer proteinler elde etmenin anahtarı, işlemin doğruluğu ve düşük sıcaklık koşullarının sağlanmasıdır.

Bu makalenin herkes için değerli referanslar sağlayabileceğini, nükleer protein çıkarma sürecini optimize etmeye yardımcı olabileceğini ve deneyin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini artırabileceğini umuyorum.