Blog

Sinirbilim alanında, serebrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin işlevlerini incelemek, beynin normal fizyolojik süreçlerini ve hastalık geliştirme mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Birincil beyin mikrovasküler endotel hücre çıkarma teknolojisi, esas olarak bu hücreleri hayvan modellerinden elde ederek, endotel hücrelerinin yapısını, işlevini ve etkileşimlerini derinlemesine incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu teknoloji, ilgili hastalıkların patogenezini incelemek ve hedeflenen terapötik ilaçlar geliştirmek için önemli bir referans sağlar ve serebrovasküler hastalıklar ve nörodejeneratif hastalıklar alanında bilimsel ilerlemeyi teşvik eder.

Welso, düşük hızlı bir santrifüj kullanarak beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC'ler) ayrılması ve çıkarılması için deneysel bir protokolü dikkatlice bir araya getirdi. Makale, laboratuvar personeline deneyin temel adımlarını ve önlemlerini ayrıntılı olarak sunan ve bilimsel araştırmacıların operasyonun temel noktalarına hızla hakim olmalarına yardımcı olan özlü ve anlaşılması kolay bir teknik kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır. Bu paylaşım aracılığıyla ilgili alanlardaki araştırmalar için pratik rehberlik ve destek sağlayabileceğimizi ve serebrovasküler ve nörobilim araştırmalarının ilerlemesini hızlandırabileceğimizi umuyoruz.

BMEC'lere Giriş

Birincil beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC'ler), beyin dokusundan izole edilen, kültürlenen ve çoğaltılan önemli bir hücre türüdür. Esas olarak beyin mikro damarlarının duvarlarında dağılırlar ve kan-beyin bariyerinin temel bileşenini oluştururlar. BMEC'ler, kan-beyin bariyeri boyunca maddelerin değişimini düzenlemede, beynin iç ortamının stabilitesini korumada ve dış dünyadan gelen zararlı maddelerin istilasına karşı savunmada hayati bir rol oynarlar. Serebrovasküler işlevi ve hastalık mekanizmalarını incelemek için önemli bir hücre modelidirler.

Deneysel malzemeler

Deney hayvanları: SD sıçanlar (4-6 haftalık, erkek)

Aletler ve sarf malzemeleri: büyük cerrahi makaslar, forseps, 50 mL santrifüj tüpleri, 6-kuyucuklu plakalar

Reaktifler ve solüsyonlar: %75 etanol, tuzlu su, kolajenaz, %25 BSA, poli-lizin

Kültür ortamı: DMEM/F12 bazal kültür ortamı, DMEM/F12 tam kültür ortamı

Laboratuvar aletleri

Ultra temiz tezgah: steril çalışma için

Düşük hızlı santrifüj: hücre ayırma için

CO2 inkübatörü: hücre kültürü için uygun bir ortam sağlar

Deneysel prosedürler

Deney hayvanlarının elleçlenmesi

●Sıçanları anestezi altına aldıktan sonra, yüzey dezenfeksiyonu için yaklaşık 1 dakika boyunca %75 etanolde bekletin.

Beynin elde edilmesi

●Baştaki deriyi kesin, beyni hızla ve tamamen çıkarın ve önceden soğutulmuş DMEM/F12 bazal kültür ortamına yerleştirin.

Temizleme mendili

● Temiz bir tezgahta, beynin dış kan pıhtılarını, meninkslerini ve dış kan damarlarını çıkarın (bir kapta çalışın).

● Beyaz maddeyi (gevşek yapı) çıkarın ve gri maddeyi (kabuk şeklindeki sol ve sağ beyin parçaları) tutun.

Yıkama

●Kirlilikleri gidermek için beyin dokusunu 4°C'de önceden soğutulmuş kültür ortamı kullanarak tekrar tekrar yıkayın.

Kesme ve ön işleme

●Beyin dokusunu yaklaşık 1 mm³'lük küçük parçalara kesin ve steril 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.

●Dokuyu daha fazla kıyın ve doku parçalarını dağıtmak için nazikçe pipetleyin.

Santrifüjleme

● Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 900 rpm'de santrifüjleyin ve üstteki sıvıyı atın. 5 mL serumsuz DMEM/F12 ortamı ekleyin ve bir pipetle iyice karıştırın.

● 10 mL ortam ve 100 μL kolajenaz II ekleyin ve 37°C'de 30 ila 45 dakika boyunca sindirin.

6-kuyulu plakayı hazırlayın

●Aynı zamanda, 6-kuyulu plakayı kaplamak için 1 mL poli-lizin kullanın ve 37°C'de inkübe edin.

Sindirim sonrası işlem

●Sindirimden sonra, nötralize etmek için ortam ekleyin, oda sıcaklığında 900 rpm'de 10 dakika santrifüj edin ve üstteki sıvıyı atın.

●15 mL %25 BSA solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 2000 rpm'de 20 dakika santrifüj edin.

Hedef hücreleri çıkarın

● Santrifüjlemeden sonra tabakalaşma görünür: alt katmandaki koyu kırmızı çökelti beyin mikrovasküler hücreleridir.

● 6-kuyulu plakadaki poli-L-lizini tuzlu suyla nazikçe yıkayın ve yıkamayı iki kez tekrarlayın.

Hücre resüspansiyonu ve kültürü

● Alt beyin mikro damar tortusunu çıkarın, fizyolojik tuzlu su ekleyin ve iyice karıştırın, ardından oda sıcaklığında 900 rpm'de 5 dakika santrifüj edin.

● Hücreleri taze DMEM/F12 tam ortamıyla resüspanse edin, kaplanmış 6-kuyulu bir plakaya aktarın ve bir inkübatörde kültürleyin.

Bu deneysel prosedürle sıçan beyin mikrovasküler endotel hücrelerini başarıyla çıkardık ve ayırdık ve daha fazla araştırma için sağlam bir deneysel temel sağladık. Süreç boyunca, düşük hızlı santrifüj hücreleri verimli bir şekilde ayırmamıza ve hedef hücre popülasyonunu arındırmamıza yardımcı olan önemli bir araçtır. Deneyin doğruluğunu ve güvenliğini sağlamak için Welso, operatörler tarafından referans alınması için düşük hızlı santrifüjün bazı çalışma noktalarını derledi.

Ekipman denetimi ve yerleşimi

● Santrifüjün titreşim veya eğimden kaynaklanan dengesizliği önlemek için sağlam bir masa üzerine sabit bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.

● Kullanmadan önce ekipmanı kontrol edin ve hasar veya gevşeklik olmadığından emin olmak için rotor ve contaları kontrol etmeye odaklanın.

Çalışma koruması

● Sıvı sıçramasını ve cilde ve gözlere zarar vermesini önlemek için çalışma sırasında koruyucu gözlük ve laboratuvar eldivenleri takın.

Hız ve yük

● Ekipmanın maksimum hızına ve maksimum yüküne dikkat edin ve santrifüjün yük aralığını aşmayın.

● Deneysel gereksinimlere göre uygun santrifüjleme hızını ve süresini seçin. Hız ve süre, uygunsuz parametre ayarları nedeniyle ayırma etkisini etkilememek için numune yoğunluğuna, ayırma amacına ve hacme göre ayarlanmalıdır.

Örnek hazırlama ve yükleme

● Örnek santrifüje girmeden önce, santrifüj tüpünün, kapağın, kovanın ve adaptörün terazide doğru bir şekilde dengelendiğinden, ağırlık toleransının genellikle 1 g'dan fazla olmadığından, hassasiyet gereksiniminin 0,1 g'dan fazla olmadığından ve ekipman kılavuzunun gereksinimlerini karşıladığından emin olun.

● Santrifüj tüpüne doldurulan malzemeler, eşit olmayan yük dağılımından kaynaklanan titreşimi önlemek için benzer yoğunluğa sahip olmalıdır.

● Ekipmanın dengesizleşmesini veya hasar görmesini önlemek için örnek kapasitesi santrifüj tüpünün veya rotorun maksimum kapasite sınırını aşmamalıdır.

● Santrifüj kuvvetinin eşit şekilde dağılmasını sağlamak için örnek rotora simetrik olarak yerleştirilmelidir.

İşletim Özellikleri

●Santrifüj çalışırken kapağın açılıp kapatılması kazara yaralanmaları önlemek için yasaktır.

●Santrifüjlemeden sonra, kapağı açmadan önce rotorun tamamen durduğundan emin olun. Numuneyi çıkarırken, yüksek sıcaklıktaki numune tüpüyle temastan veya sıçrayan sıvıdan kaçınmaya dikkat edin.

Temizlik ve Bakım

●Kullanımdan sonra, ekipmanı temiz tutmak ve kirlenmeyi veya korozyonu önlemek için ekipmanı ve rotoru zamanında temizleyin.

●Ekipmanın uzun vadeli kararlılığını ve güvenilirliğini sağlamak için santrifüjün çalışma durumunu düzenli olarak kontrol edin.

●Yukarıdaki önlemleri izleyerek, deneysel işlemlerin güvenliğini sağlayabilir ve ekipmanın ömrünü uzatabilirsiniz.

Santrifüjler birçok hücre ayırma ve çıkarma deneyinde olmazsa olmazdır. Santrifüj çalışma özelliklerine sıkı sıkıya uymak yalnızca deneyin güvenliğini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda ekipmanın hizmet ömrünü uzatır ve deneysel sonuçların güvenilirliğini sağlar. Welso profesyonel bir santrifüj tedarikçisidir. Ürün sayfamız aracılığıyla düşük hızlı santrifüjlerin ayrıntılı özellikleri ve teknik parametreleri hakkında daha fazla bilgi edinebilirsiniz. Ayrıca en uygun teklifi almak için istediğiniz zaman bizimle iletişime geçmenizi bekliyoruz.