Blog

ELISA (enzim bağlantılı immünosorbent testi), antijen ve antikorun spesifik bağlanmasına dayanan bir immünoassay teknolojisidir. Temel prensibi, fiziksel adsorpsiyon yoluyla bir polistiren mikro plakanın yüzeyine belirli bir konsantrasyondaki antijeni veya antikoru sabitlemek, ardından test edilecek örneği eklemek ve enzim etiketi ile substrat arasındaki reaksiyonla üretilen renk geliştirme derecesini, test edilen antijenin veya antikorun varlığını veya yokluğunu veya miktarını dolaylı olarak yansıtmak için kullanmaktır.

Bir tür immün etiketleme teknolojisi (immünofloresan teknolojisi, immünoradyometrik teknoloji, immünoenzim teknolojisi ve immünokoloidal altın teknolojisi dahil) olan ELISA teknolojisi, hızlı, hassas, nitel veya nicel tespit özellikleri nedeniyle bilimsel araştırmalarda ve klinik deneylerde yaygın olarak kullanılmaktadır.

ELISA, moleküler biyoloji, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında yaygın olarak kullanılan deneysel yöntemlerden biridir, ancak gerçek operasyonda insanlar sıklıkla çeşitli deneysel zorluklarla karşılaşırlar. Örneğin, ELISA deneylerinde, yüksek bir blanking, yalnızca deneysel sonuçların doğruluğunu etkilemekle kalmayıp aynı zamanda verilerin güvenilirliğini de etkileyebilen yaygın sorunlardan biridir. Bu nedenle, yüksek blanking'in nedenlerini derinlemesine anlamak ve etkili optimizasyon önlemleri almak özellikle önemlidir.

Yüksek blanking, ELISA deneyinde negatif kontrol veya blank'ın absorbans değerinde anormal bir artışa işaret eder. Normalde, negatif kuyunun absorbans değeri 0,1'den az olmalıdır. Çok yüksek bir arka plan değeri deneysel sonuçları etkileyecek, verilerin doğruluğunu ve güvenilirliğini azaltacak ve numunedeki antijen veya antikorun gerçek içeriğini doğru bir şekilde değerlendirmeyi imkansız hale getirecektir.

Yaygın nedenler şunlardır:

● Plaka temiz değildir

Çözüm:

▼İyice yıkayın

Yetersiz yıkama süresi antikor kalıntılarına neden olur ve negatif kontrolün renklenmesine yol açar.

Yıkama süresini uzatmaya, yıkama sayısını artırmaya ve yıkama solüsyonuna uygun miktarda yüzey aktif madde (örneğin Tween-20, %0,05) eklemeye çalışın.

Her adımda plakayı yıkarken, yıkamanın iyice yapıldığından emin olun ve kuyuda belirgin bir sıvı kalıntısı kalmayana kadar plakaya iyice vurun.

▼Çapraz kontaminasyondan kaçının

Yıkama solüsyonunu atarken veya antikorları inkübe ederken, kuyular arasında çapraz kontaminasyondan kaçınmaya dikkat edin.

Pipet uçları, tekrarlanan kullanımdan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için mümkün olduğunca bir kez kullanılmalıdır.

Plakaya vururken kullanılan filtre kağıdı, ikincil kontaminasyonu önlemek için tekrar kullanılmamalıdır.

● Antikor veya reaktif konsantrasyonu çok yüksek

Neden: Antikor, enzimle işaretlenmiş ikincil antikor veya kromojenik substrat konsantrasyonu çok yüksek, bunun sonucunda artan spesifik olmayan reaksiyon ve artan arka plan sinyali ortaya çıkıyor.

Çözüm:

▼Antikor konsantrasyonunu optimize edin: aşırı dozu önlemek için antikoru uygun bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin.

▼Reaktif konsantrasyonunu kontrol edin: aşırı konsantrasyonu önlemek için enzimle işaretlenmiş ikincil antikor ve kromojenik substrat konsantrasyonunu kesin bir şekilde ayarlayın.

▼Gradyan seyreltme deneyi yapın: her bir reaktifin optimum konsantrasyonunu belirlemek ve körleme girişimini azaltmak için ön deneylerle kademeli olarak seyreltin.

● Eksik bloklama

Neden: Bloklama solüsyonu (BSA gibi) antikorla çapraz reaksiyona girebilir ve bu da arka plan sinyalinde artışa neden olabilir. Bloklama solüsyonu konsantrasyonu çok düşükse veya bloklama süresi çok kısaysa, bloklama tamamlanmayabilir ve antikorun ELISA plakasına spesifik olmayan bir şekilde bağlanmasına ve böylece arka plan değerinin artmasına neden olabilir.

Çözüm:

▼Uygun bir bloklama solüsyonu kullanın ve bloklama solüsyonunun konsantrasyonunu ayarlayın.

▼Bloklama süresi yeterli olmalıdır, genellikle 1-2 saat (oda sıcaklığı) veya 4°C'de bir gece.

▼Fazla bloklama solüsyonunu çıkarmak için bloklamadan sonra plaka kuyularını yıkadığınızdan emin olun.

●Renk reaksiyonu çok uzun

Neden: Uygunsuz sistem optimizasyonu nedeniyle, örnek renk reaksiyonu zayıftır. Bu eksikliği telafi etmek için renk reaksiyon süresi uzatılır. Uzun renk reaksiyon süresi, substratın spesifik olmayan reaksiyonlarında artışa yol açar.

Çözüm:

▼Tespit sistemi optimize edilmeli ve kaplama, tespit antikoru ve substrat konsantrasyonları hassas ve spesifik reaksiyonları sağlamak için ayarlanmalıdır.

▼Deneysel sonuçların doğruluğunu sağlamak ve körleme girişimini önlemek için renk reaksiyon süresini genellikle 15 dakikadan fazla olmayacak şekilde kısaltın.

● Reaktif kontaminasyonu veya bozulması

Neden: Reaktiflerin ve tamponların hazırlanması veya depolanması sırasında kontaminasyon meydana gelebilir ve bu da artan körlemeye neden olabilir.

Çözüm:

▼ Çapraz kontaminasyonu önlemek için taze hazırlanmış reaktifler kullanın.

▼ Reaktif saflığını sağlamak için filtrelenmiş solüsyonlar kullanın.

▼ Bozulmuş reaktifleri kullanmaktan kaçınmak için antikorların, substratların, yıkama solüsyonlarının ve tamponların son kullanma tarihlerini kontrol edin.

● Sıcaklık ve çevresel faktörler

Neden: Çok yüksek sıcaklık veya yüksek nem, artan nonspesifik reaksiyonlara yol açarak artan blanking ile sonuçlanır

Çözüm:

▼ İnkübatörü kontrol ederek inkübasyon sıcaklığının 37°C'de sabit olduğundan emin olun ve talimatlardaki reaksiyon süresine göre inkübe edin.

▼ Plaka kuyularını uzun süre yüksek sıcaklıklara veya güçlü ışığa maruz bırakmaktan kaçının.

Aletler ve ekipmanlar ELISA deneylerinin başarısının temelini oluşturur. Yaygın olarak kullanılan ilgili ekipmanlar arasında pipetler, mikro plaka okuyucular, plaka yıkayıcılar ve inkübatörler bulunur. Doğruluk ve hassasiyeti garantilemek için tüm ekipmanların düzenli olarak denetlenmesi ve kalibre edilmesi gerekir. Welso çeşitli ELISA deneyleri için gereken yüksek kaliteli ekipmanları sağlar. Daha fazla bilgi için bizimle iletişime geçebilirsiniz.