Blog

Trofoblastik işlevi olan hücrelere trofoblastlar denir. Trofoblastlar embriyonun dışındaki trofoblasttan kaynaklanır ve normal bir gebelikte önemli bir bağlantıdır. Embriyo implantasyonundan sonra trofoblastlar bölünür, multiplazi olur ve belirgin şekilde farklı biyolojik özelliklere sahip EVCT'ler ve villöz sitotrofoblastlar (VCT'ler) oluşturmak üzere farklılaşır.

İnsan villöz ekstravillöz trofoblastlarının izolasyon ve kültürünün temel prensibi, EVCT'nin invazyon yeteneğine sahip olması, uterus desiduasının derin kısmında agregasyon yaparak adacıklar oluşturması ve maternal ve fetal bağışıklık mikroçevresinin önemli bir parçası olan uterus desidua hücreleriyle en yakın temasta olmasıdır.

Desiduadan villöz doku seçilip enzimatik sindirimle filtre edildikten sonra öğütme ve filtreleme işlemi yapılıp yoğunluk gradyanlı santrifüjleme yapılarak hücre yoğunluğuna göre %40 yoğunluklu tabaka emilerek trofoblast hücreleri elde edildi ve EVCT farklı zamanlarda kısa süreli kültür yapılarak daha ileri saflaştırmaya tabi tutuldu.

Hücrelerin morfolojisi, fenotipi ve fonksiyonel özelliklerine göre, hücreler immünohistokimya veya floresan antikorlar ile tanımlandı, izole edildi ve saflaştırıldı ve aynı anda akım sitometrisi sınıflandırması için hücre yüzey antijenleri etiketlendi; bu, trofoblast biyolojik fonksiyonlarının derinlemesine tartışılması için bir temel oluşturdu.

Reaktifler ve Cihazlar

Reaktif:

PBS solüsyonu, D-Hanks solüsyonu, RBC lizatı

DMEM/F12 kültür ortamı, fetal sığır serumu, tripsin

Kolajenaz Tip IV, DNaz Tip I, Fibronektin (FN)

Tip IV kollajen, Matrigel, Percoll stok solüsyonu, antibiyotikler

Alet:

Oftalmik makaslar, cımbızlar, farklı boyutlarda ekranlar (80 mesh, 300 mesh)

Her türlü petri kabı, şırınga sapları, farklı özelliklerde plastik santrifüj tüpleri

1,5 ml EP tüpleri, pipetler, Welso WLR600 masa üstü düşük hızlı soğutmalı santrifüj

Manyetik kutup ve boncuk ayırma kolonları, CO2 inkübatörleri, su banyosu çalkalayıcıları, akış sitometreleri

Deneysel Prosedür

İnsan villöz ekstravillöz trofoblastlarının izolasyonu ve kültürü için temel adımlar aşağıdaki adımlara ayrılabilir:

1. Reaktif hazırlama

(1) Tip IV kolajen solüsyonu: Tip IV kolajeni %0,25'lik buzlu asetik asitle çözün ve 4 °C'de bir gece boyunca tamamen çözün, son konsantrasyon 2,0 mg/ml olsun. Kullanırken, plaka 6~10 μg/c㎡'de ve bir gece boyunca 4 °C'de paketlendi. Tip IV kolajenle kaplanmış hücre kültürü plakaları, UV ışınlamasıyla bir gece boyunca sterilize edilebilir veya %75 etanol ile durulanabilir.

(2) FN solüsyonu: 1 mg FN kuru tozunu 1 ml steril damıtılmış suda çözün, doğal olarak çözünmesi için 30 dakika oda sıcaklığında bırakın ve 1 mg/ml konsantrasyonda saklayın. 20 μl/tüp içine bölün ve -70 °C'de saklayın. (3) 20 μl FN solüsyonunu 1 ml FD besiyerinde (konsantrasyon 20 μg/ml) çözün, 35 mm çapında bir Petri kabına dökün, oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin ve besiyerini atın.

Not:

Hemen kaplanan Petri kapları kullanılabilir veya -20 °C'de saklanabilir, ancak 2 haftadan fazla olmamalıdır.

2. Taze desidua dokusu, kan pıhtılarını ve fetal zarları uzaklaştırmak için 3 kez 1x PBS ile yıkandı ve villöz doku elde edilerek oftalmik makasla 1 mm'lik 3 parçaya kesildi.

3. %0,25 tripsin ve %0,1 DNase I ekleyin, 37 °C'lik su banyosunda hafifçe çalkalayarak 5 dakika sindirin, ardından sindirimi aspire edin ve atın.

4. Kalan doku 37 °C'de bir su banyosunda 10 dakika boyunca %0,25 tripsin ve %0,1 DNase I ile sindirildi, sindirim aspire edildi ve sindirimi sonlandırmak için dana serumu eklendi. Bunu 3~4 kez tekrarlayın ve tüm üst sıvıyı toplayın.

5. Sindirilen trofoblastlar açısından zengin üst sıvı sırasıyla 80 mesh ve 300 mesh eleklerden süzüldü, süzülen sıvı toplandı, 300 g’de 10 dakika santrifüj edildi ve üst sıvı atıldı.

6. Hücre peletleri yeniden süspanse edildi ve kesikli bir Percoll gradyanında (10%~70%, her 10%'da bir gradyan) plaka edildi ve 20 dakika boyunca 1000 g'de santrifüj edildi.

7. Trofoblastlar halinde %40 yoğunluk tabakasına sahip hücreleri (p=1.048~1.062 g/ml) emdirin ve yıkamadan sonra fetal sığır serumu içeren DMEM yüksek glikozlu kültür ortamı ekleyin.

8．Hücre yoğunluğunu 5x10/ml'ye ayarlayın, önceden kaplanmış tip IV kolajen (veya FN veya Matrigel) kaplı bir plakaya yerleştirin ve kolayca yapışan fibroblastları çıkarmak için 10 dakika boyunca yapışarak inkübe edin. Kültür ortamını ilk kez değiştirmeden önce 37 °C, %5 CO2 inkübatöründe 24 saat inkübe edin.

9. 24 saat sonra, hücrelerin büyüme durumu ters faz kontrast mikroskobu altında gözlemlendi. EVCT göç edebilir ve kümeleşebilir, ancak kaynaşmaz ve çoğalma yeteneği zayıftır.

10. Elde edilen hücrelerin immünohistokimyasal tanımlaması vimentin negatif, CK7 pozitif olma özelliklerine göre yapıldı.

11. Anti-HLA-G yüzey antikoru ile işaretlendikten sonra, FACSAriaII HLA-G+ villus ekstravillöz trofoblast hücrelerini %95'ten fazla saflıkta ayırdı ve saflaştırdı.

Not

●Villoz dokusu, laboratuvar koşullarına bağlı olarak 1 mg/ml kolajenaz IV ve 0,1 mg/ml DNase I ile sindirilebilir.

●EVCT'nin zayıf bir çoğalma kapasitesi vardır ve çok fazla pasaj, hücrelerin belirli biyolojik özelliklerinin kaybına kolayca neden olabilir, bu nedenle kültürlenmiş hücrelerdeki pasaj sayısını azaltmak önemlidir.

●EVCT ve VCT, her ikisi de CK7 ifade eder ve vimentin ifade etmez ve EVCT (c-erbB-2 için pozitif) ile VCT (c-erbB-2 için negatif) arasında ayrım yapmak için c-erbB-2 immünohistokimyası ile tanımlanabilir.