Блог

Макрофаги играют решающую роль в иммунной системе организма, играя важную роль в фагоцитировании патогенов, регулировании иммунных реакций и поддержании гомеостаза тканей. Благодаря методу первичной экстракции исследователи могут избежать генетических изменений и функционального спада, которые могут быть вызваны многократными пассажами клеточных линий, и напрямую получить макрофаги с полной биологической активностью из живых организмов, что закладывает прочную основу для последующих экспериментов.

Первичные макрофаги, полученные из костного мозга, обычно круглые или овальные, когда не стимулированы, с различными размерами клеток, небольшими ядрами, в основном круглыми или овальными, рыхлым хроматином и очевидными ядрышками. Вакуоли и гранулярные вещества обычны в цитоплазме, и эти структуры тесно связаны с их фагоцитарной функцией.

Центрифуги играют важную роль в процессе извлечения клеток BMDM. Благодаря этапу центрифугирования мы можем эффективно разделять и осаждать клетки для получения высококачественных макрофагов костного мозга. Процесс центрифугирования не только помогает удалить примеси, но и обеспечивает чистоту и активность клеток, что является незаменимым ключевым звеном в процессе извлечения.

Ниже приведены подробные этапы и меры предосторожности для метода первичной экстракции макрофагов на примере мышей:

Подготовка экспериментального материала

Экспериментальные животные: мыши C57BL/J

Реагенты: питательная среда DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащая 10% FBS, 75% этанола, стерильный PBS.

Экспериментальное оборудование: одноразовые шприцы, хирургические инструменты, центрифужные пробирки, центрифуги, планшеты для культивирования клеток или культуральные колбы и т. д.

Экспериментальные этапы

●Анестезия и умерщвление: После анестезии мышей их быстро и гуманно умерщвляли путем вывиха, следуя этике экспериментов на животных и сводя к минимуму боль для мышей.

●Дезинфекция поверхности: Замочите мышей в стакане с 75% этанолом на 5 минут. После тщательной дезинфекции используйте чистое бумажное полотенце, чтобы впитать излишки спирта.

●Обработка кожи и суставов: Используйте стерилизованные ножницы, чтобы сделать небольшой надрез на спине мыши, разорвите кожу до икроножного сустава голыми руками и удалите сустав стопы и кожу.

●Отбор образцов ног и вторичная дезинфекция: Используйте стерилизованные ножницы, чтобы аккуратно разобрать задние конечности от большого вертела у основания бедра, чтобы избежать переломов. После удаления мышц замочите кости ног в чашке для культивирования с 75% этанолом на 5 минут.

●Через 5 минут извлеките кости ног из чашки Петри с этанолом, поместите их в новую чашку Петри с этанолом и перенесите на чистый стол, чтобы обеспечить стерильную среду для последующих экспериментов.

Извлечение и индукция клеток BMDM

● Предварительная обработка костей ног: Перенесите пропитанные этанолом кости ног мыши в контейнер, наполненный холодным PBS, полностью погрузите и смойте этанол на поверхности кости PBS, повторите 3 раза, чтобы обеспечить тщательную очистку.

● Извлечение костного мозга: Отделите очищенную бедренную и большеберцовую кости и отрежьте оба конца стерилизованными ножницами. Используйте шприц объемом 1 мл для впитывания холодной индукционной среды, направьте на конец кости и выдуйте костный мозг, затем продуйте и промойте несколько раз примерно 3 раза, пока в кости ноги не останется явных остатков красного костного мозга.

● Дисперсия и фильтрация клеток: Используйте пипетку объемом 5 мл, чтобы осторожно выдуть среду, содержащую клетки костного мозга, чтобы разогнать клеточные комки. Отфильтруйте суспензию через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы удалить примеси, и перенесите фильтрат в центрифужную пробирку объемом 15 мл.

● Центрифугирование и ресуспендирование: центрифугируйте при 1500 об/мин в течение 5 минут и удалите супернатант. Добавьте буфер лизиса эритроцитов, чтобы ресуспендировать клетки, дайте постоять в течение 5 минут, а затем центрифугируйте при той же скорости в течение 5 минут и удалите супернатант. Наконец, ресуспендируйте клеточный осадок с помощью холодной индукционной среды.

● Культура клеток и замена среды: высейте клетки по мере необходимости. На третий день половину культуральной среды заменили для поддержания стабильной культуральной среды; на пятый день заменили полный объем свежей культуральной среды для удовлетворения потребностей роста и дифференциации клеток; на седьмой день клетки достигли пригодного для использования состояния.

Примечания

●Клетки BMDM нельзя пассировать: из-за особых биологических характеристик клеток BMDM они не подходят для операций пассирования.

●Избегайте переваривания трипсином: трипсин часто используется для разделения адгезивных клеток, но он не подходит для клеток BMDM. Протеолитическая активность трипсина разрушит клеточную мембрану и ключевые белки, что приведет к инактивации клеток и сделает их непригодными для последующих экспериментов. Поэтому не используйте трипсин для обработки клеток BMDM.

●Рекомендуется использовать клеточный скребок: из-за ограничений пассирования и переваривания трипсином рекомендуется использовать клеточный скребок для аккуратного соскабливания клеток BMDM.

●Избегайте частой смены контейнеров для культивирования: клетки BMDM хрупкие и чувствительны к окружающей среде. Рекомендуется сразу высевать их для экспериментов после получения. Частая смена контейнеров для культивирования может вызвать физические нарушения, вызывая столкновения и вытягивание клеток, тем самым повреждая клетки и мешая экспериментальным результатам.

Выше представлен подробный процесс извлечения клеток BMDM, который будет полезен пользователям. В биологических экспериментах Welso может предоставить вам все необходимые экспериментальные инструменты. Особо стоит отметить, что наша серия центрифуг является незаменимым помощником в эксперименте. Мы сосредоточены на предоставлении высококачественных центрифуг для глобальных клиентов, включая низкоскоростные центрифуги, высокоскоростные центрифуги, охлаждаемые центрифуги, мини-центрифуги и напольные центрифуги большой емкости. Если вас интересует наша продукция, свяжитесь с нами вовремя, и вы получите лучшее предложение.