Блог

В экспериментах по молекулярной биологии и клеточной биологии высокочистая экстракция ядерных белков является ключевым шагом в изучении ядерных процессов, таких как регуляция генов, активность факторов транскрипции и структура хроматина. Из-за разницы в распределении между ядерными белками и цитоплазматическими белками, для обеспечения точности экспериментальных данных требуется метод экстракции ядерных белков с низким перекрестным загрязнением и простой операцией для получения образцов ядерных белков высокой чистоты. Кроме того, ядерные белки чувствительны к внешней среде, и особое внимание следует уделять рабочим условиям в процессе экстракции, таким как контроль температуры и использование ингибиторов протеазы, чтобы поддерживать активность белка и избегать деградации.

Особенно важно выбрать подходящий метод экстракции ядерного белка для различных экспериментальных нужд. Например, для белков, высоко экспрессируемых в ядре, таких как HIF1-α и TWIST, рекомендуется использовать набор для экстракции ядерного белка или специальный буфер для лизиса ядерного белка для экстракции. Эти методы не только оптимизируют этапы работы, но и эффективно снижают перекрестное загрязнение между цитоплазмой и ядерными белками, обеспечивая надежную основу для образцов для последующих экспериментов (таких как вестерн-блот, иммунопреципитация и т. д.).

Вот два относительно простых в использовании метода экстракции ядерного белка:

Для белков с высокой экспрессией в ядре, таких как HIF1-α и TWIST, следует использовать специальный набор для экстракции ядерного белка или буфер для лизиса ядерного белка.

Этапы извлечения ядерного белка (метод гомогенизационного измельчения)

Подготовка

Перед экспериментом по извлечению ядерного белка необходимо заранее подготовить соответствующие реагенты и буферы, чтобы обеспечить плавный ход экспериментального процесса. Ниже приведена подробная формула и использование раствора красителя трипанового синего и буфера:

Формула раствора красителя трипановый синий

Приготовление маточного раствора: Взвесьте соответствующее количество порошка трипанового синего и растворите его в 10 мл дважды дистиллированной воды, чтобы приготовить 4% (мас./об.) маточный раствор трипанового синего.

Разбавление рабочего раствора: используйте буфер PBS для разбавления материнского раствора в 10 раз, чтобы получить рабочий раствор с концентрацией 0,4%.

Применение: Смешайте 0,4% рабочий раствор трипанового синего и клеточную суспензию в объеме 1:1 для подсчета клеток или определения клеточной активности.

Формула буфера A (буфер лизиса клеток)

Состав:

10 мМ HEPES (pH 7,9, 4°C)

1,5 мМ MgCl₂

10 мМ KCl

0,5 мМ DTT (дитиотреитол)

Если вам нужно предотвратить деградацию белков плазмы, влияющую на ядерные белки, вы можете добавить 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид)

Функция:

Используется для лизиса клеточной мембраны, высвобождения клеточных ядер и обеспечения целостности клеточного ядра.

Формула буфера B (буфер для экстракции ядерного белка)

Состав:

20 мМ HEPES (pH 7,9)

25% (об./об.) глицерина

0,42 М NaCl

1,5 мМ MgCl₂

0,2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)

0,5 мМ PMSF

0,5 мМ DTT

Функция:

Разрыв ядерной мембраны и высвобождение ядерных белков с сохранением стабильности и активности белков.

Этапы экстракции ядерного белка

Сбор клеток

● Переварите клетки из колбы и соберите их в микропробирки.

● Центрифугируйте при 300 g в течение 5 мин при 4°C и утилизируйте супернатант.

● Промойте осадок клеток 3 раза буфером PBS, чтобы убедиться, что остаточные примеси удалены.

Подготовка к лизису клеток

● После центрифугирования утилизируйте супернатант. Добавьте 5-кратный объем предварительно охлажденного буфера А (например, добавьте 100 мкл буфера А на каждые 20 мкл клеточного осадка), перемешайте пипеткой и полностью суспендируйте клетки.

● Поместите клеточную суспензию на лед на 10 мин, затем центрифугируйте при 300 g в течение 5 мин при 4 °C.

Выделение ядер

● После центрифугирования слейте супернатант, снова добавьте 25-кратный объем предварительно охлажденного буфера А и аккуратно пипетируйте, чтобы ресуспендировать клетки.

● Перенесите клеточную суспензию в гомогенизатор Даунса для гомогенизации.

Мониторинг гомогенизации

● Во время процесса гомогенизации возьмите небольшое количество клеточной суспензии и смешайте ее с равным объемом 0,4% трипанового синего.

● Наблюдайте за разрывом клеточной мембраны под микроскопом:

● Если большинство клеток окрашены в синий цвет, это означает, что клеточная мембрана разорвана, и прекратите гомогенизацию.

● Если она разорвана не полностью, продолжайте гомогенизацию.

Разделение клеточного ядра и цитоплазмы

●Когда большинство клеток разорвутся, перенесите клеточную суспензию в пробирку Эппендорфа и центрифугируйте при 25 000 g в течение 20 мин при температуре 4 °C.

Результаты центрифугирования:

●В супернатанте содержатся цитоплазматические компоненты.

●В осадке находится клеточное ядро, содержащее ядерный белок.

Извлечение ядерного белка

●Соберите осадок после центрифугирования, добавьте 1 объем предварительно охлажденного буфера B и осторожно продуйте, чтобы ресуспендировать осадок.

●Перенесите суспензию в чистый гомогенизатор тканей и гомогенизируйте 30 раз, чтобы гарантировать полное высвобождение ядерного белка.

Растворение и экстракция белка

●Перенесите гомогенизированную суспензию в пробирку Эппендорфа и инкубируйте ее в низкоскоростном шейкере на льду в течение 45 минут, чтобы гарантировать полное растворение ядерного белка.

●Центрифугируйте при 25 000 g в течение 30 минут при 4 °C и соберите супернатант, который представляет собой очищенный ядерный белок.

Этапы извлечения ядерного белка (метод набора)

Подготовка

Подготовка реагента

●Уравновесьте набор для экстракции ядерного белка до комнатной температуры.

●Добавьте PMSF к реагенту для экстракции плазменного белка и реагенту для экстракции ядерного белка до конечной концентрации 1 мМ.

●Если образец содержит цистеин, добавьте DTT к обоим реагентам до конечной концентрации 0,5 мМ.

Сбор и промывка клеток

●Отделите клетки от стенки колбы и соберите их в пробирку Эппендорфа.

●Центрифугируйте при 300 g в течение 5 мин при 4°C и удалите супернатант.

●Промойте клетки 1-2 раза буфером PBS для удаления остаточных примесей.

Лизис клеток

● Центрифугируйте при 300 g в течение 10 мин при 4°C и удалите супернатант.

● Добавьте 5 объемов реагента для экстракции белков плазмы (например, добавьте 100 мкл на 20 мкл клеточного осадка) и осторожно перемешайте, переворачивая, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Будьте осторожны, чтобы не встряхивать, чтобы не допустить чрезмерного разрушения клеток.

Реакция лизиса

● Поместите клеточную суспензию на лед на 20 минут для полного лизиса клеток.

Разделение цитоплазматического белка

● Центрифугируйте при 250 g в течение 20 мин при 4°C и удалите супернатант.

● Добавьте 2 объема предварительно охлажденного реагента для экстракции белка плазмы к клеточному осадку и осторожно перемешайте.

Выделение ядер

● Используйте шприц с иглой 0,14 мм, чтобы аккуратно продуть 5 раз, чтобы полностью лизировать клеточный осадок.

● Центрифугируйте при 10 000 g в течение 30 мин при 4°C, соберите супернатант (цитоплазматический белок) и выбросьте осадок (ядерный белок).

Извлечение ядерного белка

●Добавьте 50–100 мкл реагента для извлечения ядерного белка к осадку ядерного белка и аккуратно продуйте 5 раз шприцем с иглой диаметром 0,14 мм, чтобы убедиться, что осадок полностью суспендирован.

●Поместите суспензию в низкоскоростной шейкер на льду и инкубируйте в течение 45 минут, чтобы способствовать растворению ядерного белка.

Разделение нуклеопротеинов

●Центрифугируйте при 16 000 g в течение 5 минут при 4°C и соберите супернатант, который представляет собой извлеченный клеточный ядерный белок.

Этапы экстракции ядерного белка ткани

Подготовка образца ткани

●Взвесьте образец ткани, который необходимо экстрагировать.

●Нарежьте ткань на максимально мелкие кусочки, чтобы повысить эффективность гомогенизации.

Гомогенизация ткани

●Добавьте 300–500 мкл PBS на каждые 50 мг ткани.

●Используйте гомогенизатор для полной гомогенизации в условиях ледяной бани, чтобы гарантировать полную диссоциацию ткани и образование однородной суспензии.

Центрифугирование и сбор осадка

●Центрифугируйте при 500 g в течение 3 мин при 4°C и удалите супернатант в тканевой суспензии.

●Соберите осадок, который содержит клетки и органеллы.

Извлечение ядер клеток

●Добавьте собранный осадок в 200 мкл раствора для извлечения белков плазмы.

●Продолжайте извлечение ядерных белков клеток в соответствии с вышеуказанными этапами центрифугирования.

Выбор подходящего метода должен определяться на основе экспериментальных целей, размера образца и экспериментального оборудования. В практических приложениях исследователи могут гибко выбирать подходящий метод экстракции ядерного белка на основе собственных потребностей и конкретных характеристик образца. Независимо от того, какой метод выбрать, обеспечение точности работы и низкотемпературных условий является ключом к получению высококачественных ядерных белков.

Надеюсь, эта статья станет ценным источником информации для всех, поможет оптимизировать процесс экстракции ядерного белка и повысить надежность и повторяемость эксперимента.