Блог

В области нейронауки изучение функций цереброваскулярных и микрососудистых эндотелиальных клеток имеет решающее значение для понимания нормальных физиологических процессов мозга и механизмов развития заболеваний. Технология первичной экстракции микрососудистых эндотелиальных клеток мозга широко используется, в основном путем получения этих клеток из животных моделей, для глубокого изучения структуры, функции и взаимодействия эндотелиальных клеток. Эта технология обеспечивает важную справочную информацию для изучения патогенеза связанных заболеваний и разработки целевых терапевтических препаратов, а также способствует научному прогрессу в области цереброваскулярных заболеваний и нейродегенеративных заболеваний.

Welso тщательно составили экспериментальный протокол для разделения и извлечения микрососудистых эндотелиальных клеток мозга (BMEC) с использованием низкоскоростной центрифуги. Цель статьи — предоставить лабораторному персоналу краткое и понятное техническое руководство, подробно описывающее основные этапы и меры предосторожности эксперимента, а также помогающее научным исследователям быстро освоить ключевые моменты операции. Мы надеемся, что благодаря этому обмену мы сможем предоставить практическое руководство и поддержку для исследований в смежных областях и ускорить прогресс цереброваскулярных и нейробиологических исследований.

Введение в BMEC

Первичные микрососудистые эндотелиальные клетки мозга (BMEC) являются важным типом клеток, изолированных, культивируемых и размножаемых из мозговой ткани. Они в основном распределены в стенках микрососудов мозга и составляют основной компонент гематоэнцефалического барьера. BMEC играют жизненно важную роль в регулировании обмена веществ через гематоэнцефалический барьер, поддержании стабильности внутренней среды мозга и защите от вторжения вредных веществ из внешнего мира. Они являются важной клеточной моделью для изучения цереброваскулярной функции и механизмов заболеваний.

Экспериментальные материалы

Экспериментальные животные: крысы SD (возраст 4-6 недель, самцы)

Инструменты и расходные материалы: большие хирургические ножницы, пинцет, центрифужные пробирки на 50 мл, 6-луночные планшеты

Реагенты и растворы: 75% этанола, физиологический раствор, коллагеназа, 25% BSA, полилизин

Культуральная среда: базальная культуральная среда DMEM/F12, полная культуральная среда DMEM/F12

Лабораторные приборы

Ультрачистый стол: для стерильной работы

Низкоскоростная центрифуга: для разделения клеток

CO2-инкубатор: обеспечивает подходящую среду для культивирования клеток

Экспериментальные процедуры

Обращение с экспериментальными животными

●После анестезии крыс замочите их в 75% этаноле примерно на 1 минуту для дезинфекции поверхности.

Получение мозга

● Разрежьте кожу на голове, быстро и полностью удалите мозг и поместите его в предварительно охлажденную базальную питательную среду DMEM/F12.

Очистка ткани

● На чистом столе удалите внешние сгустки крови, мозговые оболочки и внешние кровеносные сосуды мозга (работайте в чашке).

● Удалите белое вещество (рыхлую структуру) и сохраните серое вещество (раковинные левая и правая части мозга).

Промывание

●Неоднократно промойте мозговую ткань, используя предварительно охлажденную питательную среду 4°C, чтобы удалить примеси.

Нарезка и предварительная обработка

●Нарежьте мозговую ткань на небольшие кусочки размером около 1 мм³ и перенесите в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.

●Дополнительно измельчите ткань и аккуратно пипетируйте, чтобы разбросать кусочки ткани.

Центрифугирование

● Центрифугируйте при 900 об/мин в течение 4 минут при комнатной температуре и удалите супернатант. Добавьте 5 мл бессывороточной среды DMEM/F12 и тщательно перемешайте пипеткой.

● Добавьте 10 мл среды и 100 мкл коллагеназы II и переваривайте при температуре 37 °C в течение 30–45 минут.

Подготовьте 6-луночный планшет

●В то же время используйте 1 мл полилизина для покрытия 6-луночного планшета и инкубируйте при температуре 37 °C.

Обработка после переваривания

●После переваривания добавьте среду для нейтрализации, центрифугируйте при 900 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре и удалите супернатант.

●Добавьте 15 мл 25% раствора BSA и центрифугируйте при 2000 об/мин в течение 20 минут при комнатной температуре.

Извлечение целевых клеток

● После центрифугирования видна стратификация: темно-красный осадок в нижнем слое — это микрососудистые клетки мозга.

● Аккуратно промойте поли-L-лизин в 6-луночном планшете физиологическим раствором и повторите промывку дважды.

Ресуспендирование и культивирование клеток

● Удалите осадок нижних микрососудов мозга, добавьте физиологический раствор и хорошо перемешайте, затем центрифугируйте при 900 об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре.

● Ресуспендируйте клетки в свежей полной среде DMEM/F12, перенесите в покрытый 6-луночный планшет и культивируйте в инкубаторе.

Благодаря этой экспериментальной процедуре мы успешно извлекли и разделили микрососудистые эндотелиальные клетки мозга крысы, обеспечив надежную экспериментальную базу для дальнейших исследований. На протяжении всего процесса низкоскоростная центрифуга является ключевым инструментом, который помогает нам эффективно разделять клетки и очищать целевую популяцию клеток. Чтобы обеспечить точность и безопасность эксперимента, Welso собрала некоторые рабочие точки низкоскоростной центрифуги для справки операторов.

Проверка и размещение оборудования

● Убедитесь, что центрифуга установлена устойчиво на прочном столе, чтобы избежать неустойчивости, вызванной вибрацией или наклоном.

● Проверьте оборудование перед использованием и сосредоточьтесь на проверке ротора и уплотнений, чтобы убедиться в отсутствии повреждений или ослабления.

Защита при работе

● Во время работы надевайте защитные очки и лабораторные перчатки, чтобы предотвратить разбрызгивание жидкости и повреждение кожи и глаз.

Скорость и нагрузка

● Обратите внимание на максимальную скорость и максимальную нагрузку оборудования и не превышайте диапазон нагрузки центрифуги.

● Выберите подходящую скорость и время центрифугирования в соответствии с экспериментальными требованиями. Скорость и время следует регулировать в соответствии с плотностью образца, целью разделения и объемом, чтобы избежать влияния на эффект разделения из-за неправильной настройки параметров.

Подготовка и загрузка образца

● Перед тем, как образец попадет в центрифугу, убедитесь, что центрифужная пробирка, крышка, ведро и адаптер точно сбалансированы на весах, допуск веса обычно не превышает 1 г, требование к точности не превышает 0,1 г, и что он соответствует требованиям руководства по оборудованию.

● Материалы, заполняемые в центрифужной пробирке, должны иметь одинаковую плотность, чтобы избежать вибрации, вызванной неравномерным распределением нагрузки.

● Вместимость образца не должна превышать максимальный предел вместимости центрифужной пробирки или ротора, чтобы предотвратить дисбаланс или повреждение оборудования.

● Образец следует размещать в роторе симметрично, чтобы обеспечить равномерное распределение центробежной силы.

Эксплуатационные характеристики

●Запрещается открывать или закрывать крышку во время работы центрифуги, чтобы избежать случайных травм.

●После центрифугирования убедитесь, что ротор полностью остановился, прежде чем открывать крышку. При извлечении образца будьте осторожны, чтобы не соприкоснуться с высокотемпературной пробиркой для образца или брызгами жидкости.

Чистка и техническое обслуживание

●После использования своевременно очищайте оборудование и ротор, чтобы поддерживать чистоту оборудования и избегать загрязнения или коррозии.

●Регулярно проверяйте рабочее состояние центрифуги, чтобы обеспечить долгосрочную стабильность и надежность оборудования.

●Соблюдая вышеуказанные меры предосторожности, вы можете обеспечить безопасность экспериментальных операций и продлить срок службы оборудования.

Центрифуги необходимы во многих экспериментах по разделению и экстракции клеток. Строгое соблюдение рабочих характеристик центрифуги может не только обеспечить безопасность эксперимента, но и продлить срок службы оборудования и обеспечить надежность экспериментальных результатов. Welso является профессиональным поставщиком центрифуг. Вы можете узнать больше о подробных характеристиках и технических параметрах низкоскоростных центрифуг на нашей странице продукта. Мы также приглашаем вас связаться с нами в любое время, чтобы получить наиболее подходящее предложение.