Блог

ИФА (иммуноферментный анализ) — это технология иммуноанализа, основанная на специфическом связывании антигена и антитела. Ее основной принцип заключается в фиксации антигена или антитела определенной концентрации на поверхности полистирольного микропланшета путем физической адсорбции, затем добавлении образца для тестирования и использовании степени развития цвета, полученного в результате реакции между ферментной меткой и субстратом, для косвенного отражения наличия или отсутствия или количества тестируемого антигена или антитела.

Технология ИФА, являющаяся разновидностью технологии иммуномаркирования (включая технологию иммунофлуоресценции, иммунорадиометрическую технологию, иммуноферментную технологию и технологию иммуноколлоидного золота), широко используется в научных исследованиях и клинических экспериментах благодаря своим характеристикам быстрого, чувствительного, качественного или количественного обнаружения.

ELISA является одним из наиболее часто используемых экспериментальных методов в молекулярной биологии, иммунологии и исследованиях клеточной биологии, но в реальной работе люди часто сталкиваются с различными экспериментальными трудностями. Например, в экспериментах ELISA высокая степень бланкирования является одной из распространенных проблем, которая не только влияет на точность экспериментальных результатов, но и может повлиять на надежность данных. Поэтому особенно важно глубоко понять причины высокой степени бланкирования и принять эффективные меры оптимизации.

Высокий уровень гашения относится к аномальному увеличению значения поглощения отрицательного контроля или бланка в эксперименте ELISA. Обычно значение поглощения отрицательной лунки должно быть меньше 0,1. Слишком высокое фоновое значение помешает экспериментальным результатам, снизит точность и надежность данных и сделает невозможной точную оценку истинного содержания антигена или антитела в образце.

Распространенные причины включают в себя:

● Тарелка не чистая

Решение:

▼Тщательно промойте

Недостаточное время промывки приведет к появлению остатков антител, что приведет к окрашиванию отрицательного контроля.

Попробуйте увеличить время промывки, увеличить количество промывок и добавить соответствующее количество поверхностно-активного вещества (например, Твин-20, 0,05%) в промывочный раствор.

При промывке планшета на каждом этапе убедитесь, что промывка тщательная, и тщательно постучите по планшету, пока в лунке не останется видимых остатков жидкости.

▼Избегайте перекрестного загрязнения

При сливании промывочного раствора или инкубации антител будьте осторожны, чтобы избежать перекрестного загрязнения между лунками.

Наконечники пипеток следует использовать как можно чаще один раз, чтобы предотвратить загрязнение, вызванное повторным использованием.

Фильтровальную бумагу, используемую при постукивании по планшету, не следует использовать повторно, чтобы избежать вторичного загрязнения.

● Слишком высокая концентрация антител или реагентов

Причина: слишком высокая концентрация антител, меченых ферментом вторичных антител или хромогенного субстрата, что приводит к увеличению неспецифической реакции и усилению фонового сигнала.

Решение:

▼Оптимизируйте концентрацию антител: разбавьте антитело до подходящей рабочей концентрации, чтобы избежать передозировки.

▼Контролируйте концентрацию реагента: строго отрегулируйте концентрацию меченых ферментом вторичных антител и хромогенного субстрата, чтобы предотвратить избыточную концентрацию.

▼Проведите эксперимент с градиентным разбавлением: постепенно разбавляйте в ходе предварительных экспериментов, чтобы определить оптимальную концентрацию каждого реагента и уменьшить помехи гашения.

● Неполная блокировка

Причина: Блокирующий раствор (например, BSA) может перекрестно реагировать с антителом, что приводит к увеличению фонового сигнала. Если концентрация блокирующего раствора слишком низкая или время блокирования слишком короткое, блокировка может быть неполной, что приведет к неспецифическому связыванию антитела с планшетом ELISA, тем самым увеличивая фоновое значение.

Решение:

▼Используйте подходящий блокирующий раствор и отрегулируйте концентрацию блокирующего раствора.

▼Время блокировки должно быть достаточным, обычно 1-2 часа (комнатная температура) или в течение ночи при 4 °C.

▼Обязательно промойте лунки планшета после блокировки, чтобы удалить избыток блокирующего раствора.

●Цветная реакция слишком длинная

Причина: Из-за неправильной оптимизации системы цветная реакция образца слабая. Чтобы компенсировать этот недостаток, время цветной реакции увеличивается. Длительное время цветной реакции приводит к увеличению неспецифических реакций субстрата.

Решение:

▼Система обнаружения должна быть оптимизирована, а концентрации покрытия, антитела обнаружения и субстрата должны быть скорректированы для обеспечения чувствительных и специфичных реакций.

▼Сократите время цветной реакции, как правило, не более чем на 15 минут, чтобы обеспечить точность экспериментальных результатов и избежать помех бланкирования.

● Загрязнение или деградация реагента

Причина: загрязнение может произойти во время приготовления или хранения реагентов и буферов, что приведет к увеличению бланкирования.

Решение:

▼ Используйте свежеприготовленные реагенты, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

▼ Используйте отфильтрованные растворы, чтобы гарантировать чистоту реагентов.

▼ Проверяйте сроки годности антител, субстратов, промывочных растворов и буферов, чтобы избежать использования испорченных реагентов.

● Температура и факторы окружающей среды

Причина: Слишком высокая температура или высокая влажность приведут к усилению неспецифических реакций, что приведет к увеличению бланкирования

Решение:

▼ Проверьте инкубатор, чтобы убедиться, что температура инкубации стабильна на уровне 37 °C, и инкубируйте в соответствии со временем реакции, указанным в инструкции.

▼ Избегайте длительного воздействия высоких температур или яркого света на лунки планшета.

Инструменты и оборудование являются основой успеха экспериментов ELISA. Обычно используемое сопутствующее оборудование включает пипетки, микропланшетные ридеры, мойщики планшетов и инкубаторы. Все оборудование необходимо регулярно проверять и калибровать для обеспечения точности и воспроизводимости. Welso предоставляет высококачественное оборудование, необходимое для различных экспериментов ELISA. Свяжитесь с нами для получения дополнительной информации.