Блог

Клетки с трофобластической функцией называются трофобластами, которые происходят из трофобласта вне эмбриона и являются ключевым звеном нормальной беременности. После имплантации эмбриона трофобласты делятся, мультиплазия и дифференцируются, образуя EVCT и ворсинчатые цитотрофобласты (VCT) с отчетливо различающимися биологическими характеристиками.

Основной принцип выделения и культивирования ворсинчатых вневорсинчатых трофобластов человека заключается в том, что ЭВКТ обладает способностью проникать, агрегировать в глубокой части децидуальной оболочки матки, образуя островки, и находится в тесном контакте с клетками децидуальной оболочки матки, что является важной частью иммунной микросреды матери и плода.

Ворсинчатую ткань отбирали из децидуальной оболочки и фильтровали путем ферментативного расщепления, затем измельчали и фильтровали, проводили центрифугирование в градиенте плотности, и слой плотностью 40% поглощали в соответствии с плотностью клеток для получения клеток трофобласта, а EVCT далее очищали путем краткосрочного культивирования в разное время.

В соответствии с морфологией, фенотипом и функциональными характеристиками клеток, клетки были идентифицированы, выделены и очищены с помощью иммуногистохимии или флуоресцентных антител, которые одновременно маркировали антигены клеточной поверхности для сортировки методом проточной цитометрии, что создает основу для углубленного обсуждения биологических функций трофобласта.

Реагенты и инструменты

Реагент:

Раствор PBS, раствор D-Hanks, лизат эритроцитов

Культуральная среда DMEM/F12, сыворотка плода крупного рогатого скота, трипсин

Коллагеназа типа IV, ДНКаза типа I, фибронектин (FN)

Коллаген типа IV, Матригель, исходный раствор Перколла, антибиотики

Инструмент:

Офтальмологические ножницы, пинцеты, экраны разных размеров (80 меш, 300 меш)

Все виды чашек Петри, ручки для шприцев, пластиковые центрифужные пробирки разных спецификаций

1,5 мл пробирки EP, пипетки, настольная низкоскоростная охлаждаемая центрифуга Welso WLR600

Магнитные полюса и колонки для сортировки шариков, инкубаторы CO2, шейкеры с водяной баней, проточные цитометры

Экспериментальная процедура

Основные этапы выделения и культивирования ворсинчатых вневорсинчатых трофобластов человека можно разделить на следующие этапы:

1. Подготовка реагента

(1) Раствор коллагена IV типа: растворите коллаген IV типа в 0,25% ледяной уксусной кислоте и полностью растворите его при 4 °C в течение ночи с конечной концентрацией 2,0 мг/мл. При использовании планшет был упакован в концентрации 6~10 мкг/см2 и оставлен на ночь при 4 °C. Планшеты для клеточной культуры, покрытые коллагеном IV типа, можно стерилизовать в течение ночи с помощью УФ-облучения или промыть 75% этанолом.

(2) Раствор FN: растворите 1 мг сухого порошка FN в 1 мл стерильной дистиллированной воды, оставьте при комнатной температуре на 30 минут для естественного растворения и храните при концентрации 1 мг/мл. Разлейте по 20 мкл/пробирке и храните при -70 °C.

(3) Растворите 20 мкл раствора FN в 1 мл среды FD (концентрация 20 мкг/мл), вылейте в чашку Петри диаметром 35 мм, инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут и слейте среду.

Примечание:

Чашки Петри с нанесенным покрытием можно использовать и хранить при температуре -20 °C, но не более 2 недель.

2. Свежую децидуальную ткань трижды промывали однократным PBS для удаления сгустков крови и плодных оболочек, затем брали ворсинчатую ткань и разрезали ее на 3 части размером 1 мм с помощью офтальмологических ножниц.

3. Добавьте 0,25% трипсина и 0,1% ДНКазы I, расщепляйте на водяной бане при температуре 37 °C при осторожном встряхивании в течение 5 минут, затем аспирируйте расщепляемый материал и выбросьте.

4. Оставшуюся ткань переварили 0,25% трипсином и 0,1% ДНКазой I на водяной бане при 37 °C в течение 10 минут, переваривание аспирировали, и добавили 10% телячьей сыворотки для завершения переваривания. Повторите это 3~4 раза и соберите весь супернатант.

5. Переваренный супернатант, богатый трофобластами, поочередно фильтровали через сито 80 и 300 меш, отфильтрованную жидкость собирали, центрифугировали при 300 g в течение 10 минут, а супернатант отбрасывали.

6. Клеточные осадки ресуспендировали и высевали на прерывистый градиент Перколла (10%~70%, один градиент на 10%) и центрифугировали при 1000 g в течение 20 мин.

7. Абсорбируйте клетки с плотностью слоя 40% (p=1,048~1,062 г/мл) в качестве трофобластов и добавьте культуральную среду DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащую 10% эмбриональной бычьей сыворотки после промывания.

8. Отрегулируйте плотность клеток до 5x10/мл, посадите в предварительно покрытую коллагеном типа IV (или FN или Matrigel) пластину и инкубируйте адгезивно в течение 10 минут, чтобы удалить легко прилипающие фибробласты. Инкубируйте в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 в течение 24 часов перед первой заменой питательной среды.

9. Через 24 ч статус роста клеток наблюдался под инвертированным фазово-контрастным микроскопом. EVCT может мигрировать и агрегировать, но не сливается, а пролиферативная способность слаба.

10. Иммуногистохимическую идентификацию полученных клеток проводили на основании характеристик виментин отрицательные, CK7 положительные.

11. После маркировки поверхностными антителами против HLA-G FACSAriaII отсортировал и очистил клетки трофобласта вневорсинчатых ворсин HLA-G+ с чистотой >95%.

Примечание

●Ворсинчатую ткань можно переварить с помощью 1 мг/мл коллагеназы IV и 0,1 мг/мл ДНКазы I в зависимости от лабораторных условий.

●EVCT обладает слабой пролиферативной способностью, и слишком большое количество пассажей может легко привести к потере определенных биологических характеристик клеток, поэтому важно сократить количество пассажей в культивируемых клетках.

●EVCT и VCT оба экспрессируют CK7 и не экспрессируют виментин, и их можно идентифицировать с помощью иммуногистохимии c-erbB-2, чтобы отличить EVCT (положительный для c-erbB-2) от VCT (отрицательный для c-erbB-2).