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Os macrófagos são essenciais no sistema imunitário do organismo, desempenhando um papel importante na fagocitação de agentes patogénicos, na regulação das respostas imunitárias e na manutenção da homeostasia dos tecidos. Através do método de extração primária, os investigadores podem evitar as alterações genéticas e o declínio funcional que podem ser causados por múltiplas passagens de linhagens celulares e obter diretamente macrófagos com atividade biológica completa a partir de organismos vivos, o que estabelece uma base sólida para experiências subsequentes.

Os macrófagos primários derivados da medula óssea são geralmente redondos ou ovais quando não estimulados, com tamanhos de células variados, núcleos pequenos, principalmente redondos ou ovais, cromatina frouxa e nucléolos evidentes. Os vacúolos e as substâncias granulares são comuns no citoplasma, estando estas estruturas intimamente relacionadas com a sua função fagocítica.

As centrífugas desempenham um papel vital no processo de extração das células BMDM. Através da etapa de centrifugação, podemos separar e precipitar eficazmente as células para obter macrófagos de medula óssea de alta qualidade. O processo de centrifugação não só ajuda a remover as impurezas, como também garante a pureza e a atividade das células, o que é um elo essencial indispensável no processo de extração.

A seguir são apresentadas as etapas detalhadas e as precauções para o método de extração primária de macrófagos utilizando ratinhos como exemplo:

Preparação de material experimental

Animais experimentais: ratinhos C57BL/J

Reagentes: meio de cultura DMEM de alta glicose contendo 10% de SFB, 75% de etanol, PBS estéril.

Equipamento experimental: seringas descartáveis, instrumentos cirúrgicos, tubos de centrífuga, centrífugas, placas de cultura celular ou frascos de cultura, etc.

Etapas experimentais

●Anestesia e sacrifício: Após anestesiar os ratos, estes foram mortos de forma rápida e humana por deslocamento, seguindo a ética das experiências com animais e minimizando a dor dos ratos.

●Desinfeção da superfície: Mergulhe os ratos num gobelé contendo etanol a 75% durante 5 minutos. Após a desinfeção completa, utilize uma toalha de papel limpa para absorver o excesso de álcool.

●Tratamento da pele e das articulações: Utilize uma tesoura esterilizada para fazer uma pequena incisão nas costas do rato, rasgue a pele até à articulação da barriga da perna com as mãos nuas e retire a articulação do pé e a pele.

●Recolha de amostras das pernas e desinfeção secundária: Utilize uma tesoura esterilizada para desmontar cuidadosamente os membros posteriores do trocanter maior na raiz da coxa, de modo a evitar fraturas. Após remover os músculos, mergulhe os ossos das pernas numa placa de cultura com etanol a 75% durante 5 minutos.

●Após 5 minutos, retire os ossos da perna da placa de cultura de etanol, coloque-os numa nova placa de cultura de etanol e mova-os para a bancada limpa para proporcionar um ambiente estéril para as experiências subsequentes.

Extração e indução de células BMDM

● Pré-tratamento do osso da perna: Transfira os ossos da perna do ratinho embebidos em etanol para um recipiente cheio de PBS frio, mergulhe completamente e enxague o etanol na superfície do osso com PBS, repita 3 vezes para garantir uma limpeza completa.

● Extração da medula óssea: Separe o fémur e a tíbia limpos e corte ambas as extremidades com uma tesoura esterilizada. Utilize uma seringa de 1 mL para absorver o meio de indução frio, aponte para a extremidade do osso e sopre a medula óssea, depois sopre e lave repetidamente durante cerca de 3 vezes até que não haja resíduos evidentes de medula óssea vermelha no osso da perna .

● Dispersão e filtração das células: Utilize uma pipeta de 5 mL para soprar suavemente o meio que contém células da medula óssea para dispersar os grupos celulares. Filtre a suspensão através de um filtro de células de 70 μm para remover as impurezas e transfira o filtrado para um tubo de centrífuga de 15 mL.

● Centrifugação e ressuspensão: Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos e rejeitar o sobrenadante. Adicione tampão de lise de glóbulos vermelhos para ressuspender as células, deixe repousar durante 5 minutos e depois centrifugue à mesma velocidade durante 5 minutos e rejeite o sobrenadante. Por fim, ressuspenda o pellet celular com meio de indução frio.

● Cultura celular e substituição do meio: Semeie as células conforme necessário. No terceiro dia, metade do meio de cultura foi substituído para manter um ambiente de cultura estável; ao quinto dia, foi reposta a quantidade total de meio de cultura fresco para satisfazer as necessidades de crescimento e diferenciação celular; ao sétimo dia, as células atingiram um estado utilizável.

Notas

● As células BMDM não podem ser passadas: Devido às características biológicas especiais das células BMDM, estas não são adequadas para operações de passagem.

●Evitar a digestão com tripsina: a tripsina é frequentemente utilizada para separar as células aderentes, mas não é adequada para as células BMDM. A atividade proteolítica da tripsina irá destruir a membrana celular e as proteínas chave, provocando inativação celular e impossibilidade de utilização em experiências subsequentes. Por isso, não utilize tripsina para tratar células BMDM.

●É recomendado o uso de um raspador de células: Devido às limitações de passagem e digestão da tripsina, é recomendado o uso de um raspador de células para raspar suavemente as células BMDM.

●Evite trocas frequentes de recipientes de cultura: as células BMDM são frágeis e sensíveis ao ambiente. Recomenda-se plaqueá-los diretamente para experiências após a aquisição. As trocas frequentes de recipientes de cultura podem causar perturbações físicas, provocando colisões e puxões de células, danificando as células e interferindo com os resultados experimentais.

O texto acima é um processo detalhado de extração de células BMDM que será útil aos utilizadores. Em experiências biológicas, a Welso pode fornecer todos os instrumentos experimentais necessários. Vale a pena referir que a nossa série de centrífugas é um assistente indispensável na experiência. O nosso foco é fornecer produtos de centrífuga de alta qualidade a clientes globais, incluindo centrífugas de baixa velocidade, centrífugas de alta velocidade, centrífugas refrigeradas, minicentrífugas e centrífugas de pavimento de grande capacidade. Se estiver interessado nos nossos produtos, contacte-nos a tempo e receberá o melhor orçamento.