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Em experiências de biologia molecular e biologia celular, a extração de proteínas nucleares de elevada pureza é um passo fundamental no estudo de processos nucleares, como a regulação genética, a atividade dos fatores de transcrição e a estrutura da cromatina. Devido à diferença de distribuição entre as proteínas nucleares e as proteínas citoplasmáticas, para garantir a precisão dos dados experimentais, é necessário um método de extração de proteínas nucleares com baixa contaminação cruzada e fácil operação para obter amostras de proteínas nucleares de alta pureza. Além disso, as proteínas nucleares são sensíveis ao meio exterior, devendo ser dada especial atenção às condições operacionais durante o processo de extração, como o controlo da temperatura e a utilização de inibidores de proteases, para manter a atividade proteica e evitar a degradação.

É particularmente importante escolher o método apropriado de extração de proteínas nucleares para diferentes necessidades experimentais. Por exemplo, para proteínas altamente expressas no núcleo, como o HIF1-α e o TWIST, recomenda-se a utilização de um kit de extração de proteínas nucleares ou de um tampão de lise de proteínas nucleares dedicado para a extração. Estes métodos não só otimizam as etapas da operação, como também reduzem eficazmente a contaminação cruzada entre o citoplasma e as proteínas nucleares, fornecendo uma base amostral fiável para experiências subsequentes (como Western Blot, imunoprecipitação, etc.).

Eis dois métodos de extração de proteínas nucleares relativamente fáceis de utilizar:

Para proteínas com elevada expressão no núcleo, como o HIF1-α e o TWIST, deve ser utilizado um kit especial de extração de proteínas nucleares ou tampão de lise de proteínas nucleares para a extração.

Etapas de extração da proteína nuclear (método de moagem por homogeneização)

Preparação

Antes da experiência de extração de proteínas nucleares, os reagentes e tampões relevantes precisam de ser preparados com antecedência para garantir que o processo experimental decorre sem problemas. A seguir, a fórmula detalhada e a utilização da solução corante e tampão Trypan Blue:

Fórmula de solução de corante Trypan Blue

Preparação da solução-mãe: Pese uma quantidade apropriada de pó de azul de tripano e dissolva-o em 10 mL de água bidestilada para preparar uma solução-mãe de azul de tripano a 4% (m/v).

Diluição da solução de trabalho: Utilize tampão PBS para diluir a solução mãe 10 vezes, de modo a obter uma solução de trabalho com uma concentração de 0,4%.

Utilização: Misturar a solução de trabalho azul Trypan 0,4% e a suspensão celular num volume de 1:1 para contagem celular ou deteção da atividade celular.

Fórmula do tampão A (tampão de lise celular)

Ingredientes:

HEPES 10 mM (pH 7,9, 4°C)

1,5 mM de MgCl₂

KCl 10 mM

DTT 0,5 mM (ditiotreitol)

Se precisar de evitar que a degradação das proteínas plasmáticas afete as proteínas nucleares, pode adicionar PMSF 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonilo)

Função:

Utilizado para lise da membrana celular, libertação de núcleos celulares e garantia da integridade do núcleo celular.

Fórmula do tampão B (tampão de extração de proteínas nucleares)

Ingredientes:

HEPES 20 mM (pH 7,9)

25% (v/v) de glicerol

0,42 M de NaCl

1,5 mM de MgCl₂

EDTA 0,2 mM (ácido etilenodiaminotetracético)

PMSF 0,5 mM

TDT 0,5 mM

Função:

Romper a membrana nuclear e libertar proteínas nucleares, mantendo a estabilidade e a atividade das proteínas.

Etapas de extração de proteína nuclear

Recolha de células

● Digerir as células do frasco e recolhê-las em microtubos.

● Centrifugar a 300 g durante 5 min a 4°C e eliminar o sobrenadante.

● Lave a precipitação celular 3 vezes com tampão PBS para garantir que as impurezas residuais são removidas.

Preparação para lise celular

● Após a centrifugação, rejeite o sobrenadante. Adicione 5 vezes o volume de tampão A pré-arrefecido (por exemplo, adicione 100 μL de tampão A por cada 20 μL de precipitação celular), pipete para misturar e suspenda totalmente as células.

● Coloque a suspensão celular em gelo durante 10 minutos e, em seguida, centrifugue a 300 g durante 5 minutos a 4°C.

Libertação de núcleo

● Após a centrifugação, rejeite o sobrenadante, volte a adicionar 25 vezes o volume do tampão A pré-arrefecido e pipete suavemente para ressuspender as células.

● Transfira a suspensão celular para um homogeneizador Dounce para homogeneização.

Monitorização de homogeneização

● Durante o processo de homogeneização, pegue numa pequena quantidade de suspensão celular e misture com um volume igual de corante azul de tripano a 0,4%.

●Observe a rutura da membrana celular ao microscópio:

●Se a maioria das células estiver corada a azul, significa que a membrana celular foi rompida e interrompeu a homogeneização.

●Se não estiver completamente rompido, continue a homogeneização.

Separação do núcleo celular e do citoplasma

●Quando a maioria das células estiver rompida, transfira a suspensão celular para um tubo Eppendorf e centrifugue a 25 000 g durante 20 min a 4°C.

Resultados da centrifugação:

●O sobrenadante contém componentes citoplasmáticos.

●O precipitado é o núcleo da célula, que contém proteínas nucleares.

Extração de proteína nuclear

●Recolha o precipitado após a centrifugação, adicione 1 volume de tampão B pré-arrefecido e sopre suavemente para ressuspender o precipitado.

●Transfira a suspensão para um homogeneizador de tecidos limpo e homogeneize 30 vezes para garantir que a proteína nuclear é totalmente libertada.

Dissolução e extração de proteínas

●Transfira a suspensão homogeneizada para um tubo Eppendorf e incube-a num agitador de baixa velocidade com gelo durante 45 minutos para garantir que a proteína nuclear está totalmente dissolvida.

●Centrifugar a 25.000 g durante 30 min a 4°C e recolher o sobrenadante, que é a proteína nuclear purificada.

Etapas de extração de proteínas nucleares (método kit)

Preparação

Preparação de reagentes

●Equilibre o kit de extração de proteínas nucleares à temperatura ambiente.

●Adicione PMSF ao reagente de extração de proteínas plasmáticas e ao reagente de extração de proteínas nucleares até uma concentração final de 1 mM.

●Se a amostra contiver cisteína, adicione DTT a ambos os reagentes até uma concentração final de 0,5 mM.

Recolha e lavagem de células

●Digerir as células da parede do frasco e recolhê-las num tubo Eppendorf.

●Centrifugar a 300 g durante 5 min a 4°C e rejeitar o sobrenadante.

●Lave as células 1-2 vezes com tampão PBS para remover as impurezas residuais.

Lise celular

● Centrifugar a 300 g durante 10 min a 4°C e rejeitar o sobrenadante.

● Adicione 5 volumes de reagente de extração de proteínas plasmáticas (por exemplo, adicione 100 μL por 20 μL de pellet de células) e misture suavemente invertendo para garantir que as células ficam suspensas uniformemente. Tenha cuidado para evitar o vórtice para evitar a rutura celular excessiva.

Reação de lise

● Coloque a suspensão celular em gelo durante 20 minutos para lisar completamente as células.

Separação de proteínas citoplasmáticas

● Centrifugar a 250 g durante 20 min a 4°C e rejeitar o sobrenadante.

● Adicione 2 volumes de reagente de extração de proteínas plasmáticas pré-arrefecidas ao sedimento celular e misture suavemente.

Libertação nuclear

● Utilize uma seringa com uma agulha de 0,14 mm para soprar suavemente 5 vezes para lisar completamente o sedimento celular.

● Centrifugar a 10.000 g durante 30 min a 4°C, recolher o sobrenadante (proteína citoplasmática) e rejeitar o sedimento (proteína nuclear).

Extração de proteína nuclear

●Adicione 50-100 μL de reagente de extração de proteínas nucleares ao precipitado de proteínas nucleares e sopre suavemente 5 vezes com uma seringa de agulha de 0,14 mm de diâmetro para garantir que o precipitado está totalmente suspenso.

●Coloque a suspensão num agitador de baixa velocidade com gelo e incube durante 45 minutos para promover a dissolução da proteína nuclear.

Separação de nucleoproteínas

●Centrifugar a 16.000 g durante 5 minutos a 4ºC e recolher o sobrenadante, que é a proteína nuclear celular extraída.

Etapas de extração de proteína nuclear de tecido

Preparação de amostra de tecido

●Pese a amostra de tecido a extrair.

●Corte o tecido em pedaços tão pequenos quanto possível para aumentar a eficiência da homogeneização.

Homogeneização de tecidos

●Adicione 300-500 μL de PBS por cada 50 mg de tecido.

●Utilize um homogeneizador para homogeneizar totalmente em condições de banho de gelo, de modo a garantir que o tecido está completamente dissociado e forma uma suspensão uniforme.

Centrifugação e recolha de precipitados

●Centrifugar a 500 g durante 3 min a 4°C e rejeitar o sobrenadante para a suspensão de tecido.

●Recolher o precipitado, que contém células e organitos.

Extração nuclear celular

●Adicione o precipitado recolhido a 200 μL de solução de extração de proteínas plasmáticas.

●Continue a extrair a proteína nuclear celular de acordo com os passos de centrifugação acima referidos.

A seleção de um método adequado deve ser determinada com base nos objetivos experimentais, no tamanho da amostra e no equipamento experimental. Nas aplicações práticas, os investigadores podem selecionar com flexibilidade um método adequado de extração de proteínas nucleares com base nas suas próprias necessidades e nas características específicas da amostra. Independentemente do método escolhido, garantir a precisão da operação e as condições de baixa temperatura é a chave para a obtenção de proteínas nucleares de alta qualidade.

Espero que este artigo possa fornecer referências valiosas para todos, ajudar a otimizar o processo de extração de proteínas nucleares e melhorar a fiabilidade e repetibilidade da experiência.