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No campo da neurociência, o estudo das funções das células endoteliais cerebrovasculares e microvasculares é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos normais do cérebro e dos mecanismos de desenvolvimento da doença. A tecnologia de extração de células endoteliais microvasculares cerebrais primárias tem sido amplamente utilizada, principalmente pela obtenção destas células a partir de modelos animais, para explorar profundamente a estrutura, função e interações das células endoteliais. Esta tecnologia fornece uma importante referência para o estudo da patogénese de doenças relacionadas e para o desenvolvimento de medicamentos terapêuticos direcionados, além de promover o progresso científico no campo das doenças cerebrovasculares e das doenças neurodegenerativas.

Welso elaborou cuidadosamente um protocolo experimental para a separação e extração de células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) utilizando uma centrífuga de baixa velocidade. O artigo tem como objetivo fornecer ao pessoal do laboratório um guia técnico conciso e de fácil compreensão, apresentando detalhadamente as principais etapas e precauções da experiência e ajudando os investigadores científicos a dominar rapidamente os pontos-chave da operação. Esperamos que através desta partilha possamos fornecer orientação prática e apoio à investigação em áreas relacionadas e acelerar o progresso da investigação cerebrovascular e das neurociências.

Introdução aos BMECs

As células endoteliais microvasculares cerebrais primárias (BMECs) são um tipo importante de células isoladas, cultivadas e expandidas do tecido cerebral. Estão distribuídos principalmente nas paredes dos microvasos cerebrais e constituem o componente central da barreira hematoencefálica. Os BMECs desempenham um papel vital na regulação da troca de substâncias através da barreira hematoencefálica, na manutenção da estabilidade do ambiente interno do cérebro e na defesa contra a invasão de substâncias nocivas do mundo exterior. São um importante modelo celular para estudar a função cerebrovascular e os mecanismos da doença.

Materiais experimentais

Animais experimentais: ratos SD (4-6 semanas de idade, machos)

Instrumentos e consumíveis: tesouras cirúrgicas de grandes dimensões, pinças, tubos de centrífuga de 50 mL, placas de 6 poços

Reagentes e soluções: etanol a 75%, soro fisiológico, colagenase, BSA a 25%, polilisina

Meio de cultura: meio de cultura basal DMEM/F12, meio de cultura completo DMEM/F12

Instrumentos de laboratório

Bancada ultralimpa: para operação estéril

Centrífuga de baixa velocidade: para separação de células

Incubadora de CO2: proporciona um ambiente adequado para a cultura celular

Procedimentos experimentais

Maneio de animais experimentais

●Após anestesiar os ratos, mergulhe-os em etanol a 75% durante cerca de 1 minuto para desinfeção da superfície.

Obtendo o cérebro

● Corte a pele da cabeça, retire rápida e completamente o cérebro e coloque-o em meio de cultura basal DMEM/F12 pré-arrefecido.

Lenço de limpeza

● Numa bancada limpa, remova os coágulos sanguíneos externos, as meninges e os vasos sanguíneos externos do cérebro (opere num prato).

● Retire a substância branca (estrutura frouxa) e mantenha a substância cinzenta (partes cerebrais esquerda e direita em forma de concha).

Lavando

●Lave repetidamente o tecido cerebral utilizando meio de cultura pré-arrefecido a 4°C para remover as impurezas.

Corte e processamento preliminar

●Cortar o tecido cerebral em pequenos pedaços com cerca de 1 mm³ e transferir para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.

●Pique ainda mais o tecido e pipete suavemente para dispersar os pedaços de tecido.

Centrifugação

● Centrifugar a 900 rpm durante 4 minutos à temperatura ambiente e rejeitar o sobrenadante. Adicione 5 mL de meio DMEM/F12 sem soro e misture bem com uma pipeta.

● Adicionar 10 mL de meio e 100 μL de colagenase II e digerir a 37°C durante 30 a 45 minutos.

Prepare placa de 6 poços

●Ao mesmo tempo, utilize 1 mL de polilisina para revestir a placa de 6 poços e incube a 37°C.

Tratamento pós-digestão

●Após a digestão, adicione meio para neutralizar, centrifugue a 900 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente e rejeite o sobrenadante.

●Adicione 15 mL de solução de BSA a 25% e centrifugue a 2000 rpm durante 20 minutos à temperatura ambiente.

Extraia células alvo

● Após a centrifugação, a estratificação é visível: o precipitado vermelho escuro na camada inferior são as células microvasculares do cérebro.

● Lave suavemente a poli-L-lisina na placa de 6 poços com soro fisiológico e repita a lavagem duas vezes.

Ressuspensão celular e cultura

● Retire o sedimento dos microvasos cerebrais inferiores, adicione solução salina fisiológica e misture bem, centrifugando depois a 900 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente.

● Ressuspender as células com meio DMEM/F12 completo fresco, transferir para uma placa revestida de 6 poços e cultivar numa incubadora.

Através deste procedimento experimental, extraímos e separámos com sucesso células endoteliais microvasculares do cérebro de ratos, fornecendo uma base experimental sólida para futuras pesquisas. Durante todo o processo, a centrífuga de baixa velocidade é uma ferramenta fundamental que nos ajuda a separar as células de forma eficiente e a purificar a população de células alvo. De forma a garantir a precisão e segurança da experiência, Welso compilou alguns pontos de funcionamento da centrífuga de baixa velocidade para referência dos operadores.

Inspeção e colocação de equipamentos

● Certifique-se de que a centrífuga está colocada de forma estável sobre uma mesa sólida para evitar a instabilidade causada por vibração ou inclinação.

● Verifique o equipamento antes de utilizar e concentre-se na verificação do rotor e dos vedantes para garantir que não existem danos ou folgas.

Proteção de operação

● Utilize óculos de proteção e luvas de laboratório durante a operação para evitar salpicos de líquidos e causar danos na pele e nos olhos.

Velocidade e carga

● Tenha em atenção a velocidade máxima e a carga máxima do equipamento e não exceda a gama de carga da centrífuga.

● Selecione a velocidade e o tempo de centrifugação adequados de acordo com os requisitos experimentais. A velocidade e o tempo devem ser ajustados de acordo com a densidade da amostra, a finalidade de separação e o volume para evitar afetar o efeito de separação devido a definições inadequadas dos parâmetros.

Preparação e carregamento de amostras

● Antes de a amostra entrar na centrífuga, certifique-se de que o tubo da centrífuga, a tampa, o balde e o adaptador estão precisamente equilibrados na balança, a tolerância de peso não é geralmente superior a 1g, o requisito de precisão não é superior a 0,1g e cumpra os requisitos do manual do equipamento.

● Os materiais cheios no tubo da centrífuga devem ter uma densidade semelhante para evitar vibrações causadas pela distribuição desigual da carga.

● A capacidade da amostra não deve exceder o limite máximo de capacidade do tubo ou do rotor da centrífuga para evitar que o equipamento fique desequilibrado ou danificado.

●A amostra deve ser colocada simetricamente no rotor para garantir que a força centrífuga é distribuída uniformemente.

Especificações Operacionais

●É proibido abrir ou fechar a tampa quando a centrífuga estiver a funcionar para evitar ferimentos acidentais.

●Após a centrifugação, certifique-se de que o rotor pára completamente antes de abrir a tampa. Ao retirar a amostra, tenha cuidado para evitar o contacto com o tubo de amostra de alta temperatura ou salpicos de líquido.

Limpeza e Manutenção

●Após a utilização, limpe o equipamento e o rotor a tempo de o manter limpo e evitar contaminação ou corrosão.

●Verifique regularmente o estado de funcionamento da centrífuga para garantir a estabilidade e fiabilidade do equipamento a longo prazo.

●Seguindo as precauções acima referidas, pode garantir a segurança das operações experimentais e prolongar a vida útil do equipamento.

As centrífugas são essenciais em muitas experiências de separação e extração de células. Seguir rigorosamente as especificações operacionais da centrífuga pode não só garantir a segurança da experiência, mas também prolongar a vida útil do equipamento e garantir a fiabilidade dos resultados experimentais. A Welso é um fornecedor profissional de centrífugas. Pode saber mais sobre as características detalhadas e os parâmetros técnicos das centrífugas de baixa velocidade na nossa página de produtos. Convidamo-lo também a entrar em contacto connosco a qualquer momento para obter o orçamento mais adequado.