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ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is an immunoassay technology based on the specific binding of antigen and antibody. Its basic principle is to fix antigen or antibody of a specific concentration on the surface of a polystyrene microplate by physical adsorption, then add the sample to be tested, and use the degree of color development produced by the reaction between the enzyme label and the substrate to indirectly reflect the presence or absence or the amount of the antigen or antibody being tested.

As a type of immunolabeling technology (including immunofluorescence technology, immunoradiometric technology, immunoenzyme technology and immunocolloidal gold technology), ELISA technology has been widely used in scientific research and clinical experiments due to its characteristics of rapid, sensitive, qualitative or quantitative detection.

O ELISA (ensaio imunoenzimático) é uma tecnologia de imunoensaio baseada na ligação específica de antigénio e anticorpo. O seu princípio básico é fixar antigénio ou anticorpo de concentração específica na superfície de uma microplaca de poliestireno por adsorção física, depois adicionar a amostra a testar e utilizar o grau de desenvolvimento de cor produzido pela reação entre o rótulo da enzima e o substrato. refletir indiretamente a presença ou ausência ou a quantidade do antigénio ou anticorpo que está a ser testado.

A supressão elevada refere-se a um aumento anormal do valor de absorvância do controlo negativo ou branco na experiência ELISA. Normalmente, o valor de absorção do poço negativo deve ser inferior a 0,1. Um valor de fundo demasiado elevado interferirá com os resultados experimentais, reduzirá a precisão e a fiabilidade dos dados e tornará impossível avaliar com precisão o verdadeiro conteúdo do antigénio ou anticorpo na amostra.

As causas comuns incluem:

● A placa não está limpa

Solução:

▼Lave bem

O tempo de lavagem insuficiente provocará resíduos de anticorpos, resultando na coloração do controlo negativo.

Tente prolongar o tempo de lavagem, aumente o número de lavagens e adicione uma quantidade adequada de tensioativo (como Tween-20, 0,05%) à solução de lavagem.

Ao lavar a placa em cada etapa, certifique-se de que a lavagem é completa e bata bem na placa até que não haja nenhum líquido residual evidente no poço.

▼Evite a contaminação cruzada

Ao eliminar a solução de lavagem ou incubar anticorpos, tenha cuidado para evitar a contaminação cruzada entre poços.

As pontas de pipeta devem ser utilizadas uma vez, tanto quanto possível, para evitar a contaminação causada pelo uso repetido.

O papel de filtro utilizado na batida da placa não deve ser reutilizado para evitar contaminações secundárias.

● A concentração de anticorpos ou reagentes é demasiado elevada

Motivo: A concentração de anticorpo, anticorpo secundário marcado com enzima ou substrato cromogénico é muito elevada, resultando num aumento da reação inespecífica e num aumento do sinal de fundo.

Solução:

▼Otimize a concentração de anticorpos: dilua o anticorpo para uma concentração de trabalho adequada para evitar sobredosagens.

▼Controle a concentração do reagente: ajuste rigorosamente a concentração do anticorpo secundário marcado com enzima e do substrato cromogénico para evitar uma concentração excessiva.

▼Realizar experiência de diluição em gradiente: dilua gradualmente através de experiências preliminares para determinar a concentração ideal de cada reagente e reduzir a interferência de apagamento.

● Bloqueio incompleto

Motivo: A solução bloqueadora (como a BSA) pode reagir de forma cruzada com o anticorpo, resultando num aumento do sinal de fundo. Se a concentração da solução de bloqueio for demasiado baixa ou o tempo de bloqueio for demasiado curto, o bloqueio pode não ser completo, fazendo com que o anticorpo se ligue de forma não específica à placa ELISA, aumentando assim o valor de fundo.

Solução:

▼Utilize uma solução de bloqueio adequada e ajuste a concentração da solução de bloqueio.

▼O tempo de bloqueio deve ser suficiente, geralmente 1-2 horas (temperatura ambiente) ou durante a noite a 4°C.

▼Certifique-se de que lava os poços da placa após o bloqueio para remover o excesso de solução de bloqueio.

●A reação da cor é demasiado longa

Motivo: Devido à otimização inadequada do sistema, a reação da cor da amostra é fraca. Para compensar esta deficiência, o tempo de reação da cor é prolongado. O longo tempo de reação da cor leva a um aumento das reações inespecíficas do substrato.

Solução:

▼O sistema de deteção deve ser otimizado e as concentrações do revestimento, do anticorpo de deteção e do substrato devem ser ajustadas para garantir reações sensíveis e específicas.

▼Reduza o tempo de reação da cor, geralmente não superior a 15 minutos, para garantir a precisão dos resultados experimentais e evitar interferências de apagamento.

● Contaminação ou degradação dos reagentes

Motivo: Pode ocorrer contaminação durante a preparação ou armazenamento de reagentes e tampões, resultando num aumento do branco.

Solução:

▼ Utilize reagentes preparados recentemente para evitar a contaminação cruzada.

▼ Utilize soluções filtradas para garantir a pureza dos reagentes.

▼ Verifique as datas de validade dos anticorpos, substratos, soluções de lavagem e tampões para evitar a utilização de reagentes deteriorados.

● Temperatura e fatores ambientais

Motivo: Temperatura ou humidade demasiado elevadas levarão a reações inespecíficas melhoradas, resultando numa maior supressão

Solução:

▼ Verifique a incubadora para garantir que a temperatura de incubação é estável a 37°C e incube de acordo com o tempo de reação nas instruções.

▼ Evite expor os poços da placa a altas temperaturas ou luz forte durante muito tempo.

Os instrumentos e equipamentos são a base para o sucesso das experiências de ELISA. Os equipamentos relacionados normalmente utilizados incluem pipetas, leitores de microplacas, lavadoras de placas e incubadoras. Todos os equipamentos precisam de ser inspecionados e calibrados regularmente para garantir a exatidão e a precisão. A Welso fornece equipamentos de alta qualidade necessários para várias experiências de ELISA. Bem-vindo a contactar-nos para obter mais informações.