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As células com função trofoblástica são designadas por trofoblastos, que têm origem no trofoblasto fora do embrião e são um elo fundamental numa gravidez normal. Após a implantação do embrião, os trofoblastos dividem-se, multiplasiam-se e diferenciam-se para formar EVCTs e citotrofoblastos vilosos (VCTs) com características biológicas distintamente diferentes.

O princípio básico de isolamento e cultura de trofoblastos extravilosos vilosos humanos é que o EVCT tem a capacidade de invadir e agregar-se na parte profunda da decídua uterina para formar ilhas e está em contacto mais próximo com as células da decídua uterina, que é uma parte importante da decídua uterina.

O tecido viloso foi selecionado da decídua e filtrado por digestão enzimática, depois triturado e filtrado, e foi realizada centrifugação em gradiente de densidade, e a camada de densidade de 40% foi absorvida de acordo com a densidade das células para obter células trofoblásticas, e O EVCT foi ainda purificado por cultura de curta duração em momentos diferentes.

De acordo com a morfologia, fenótipo e características funcionais das células, as células foram identificadas, isoladas e purificadas por imunohistoquímica ou anticorpos fluorescentes que marcaram simultaneamente antigénios de superfície celular para classificação por citometria de fluxo, o que constitui uma base para uma discussão aprofundada das funções biológicas do trofoblasto.

Reagentes e Instrumentos

Reagente:

Solução PBS, solução D-Hanks, lisado de GV

Meio de cultura DMEM/F12, soro fetal bovino, tripsina

Colagenase Tipo IV, DNase Tipo I, Fibronectina (FN)

Colagénio tipo IV, Matrigel, solução-mãe Percoll, antibióticos

Instrumento:

Tesouras oftálmicas, pinças, crivos de diferentes tamanhos (80 mesh, 300 mesh)

Todos os tipos de placas de Petri, cabos de seringas, tubos de centrífuga de plástico de diferentes especificações

Tubos EP de 1,5 ml, pipetas, centrífuga refrigerada de mesa de baixa velocidade Welso WLR600

Colunas de classificação de pólos magnéticos e esferas, incubadoras de CO2, agitadores de banho-maria, citómetros de fluxo

Procedimento Experimental

As etapas básicas para o isolamento e cultura de trofoblastos extravilosos vilosos humanos podem ser divididas nas seguintes etapas:

1. Preparação dos reagentes

(1) Solução de colagénio tipo IV: dissolva o colagénio tipo IV com ácido acético glacial a 0,25% e dissolva-o totalmente a 4 °C durante a noite, com uma concentração final de 2,0 mg/ml. Ao utilizar, a placa foi embalada a 6 ~ 10 μg/c㎡ e durante a noite a 4 °C. As placas de cultura celular revestidas com colagénio tipo IV podem ser esterilizadas durante a noite com irradiação UV ou lavadas com etanol a 75%.

(2) Solução FN: dissolver 1 mg de pó seco FN em 1 ml de água destilada estéril, deixar à temperatura ambiente durante 30 minutos para o dissolver naturalmente e armazenar a uma concentração de 1 mg/ml. Alíquotar em 20 μl/tubo e armazenar a -70 °C.

(3) Dissolver 20 μl de solução de FN em 1 ml de meio FD (concentração de 20 μg/ml), verter para uma placa de Petri com um diâmetro de 35 mm, incubar à temperatura ambiente durante 45 minutos e rejeitar o meio.

Nota:

As placas de Petri imediatamente revestidas podem ser utilizadas ou armazenadas a -20 °C, mas não mais de 2 semanas.

2.º O tecido decidual fresco foi lavado três vezes com PBS 1x para remover os coágulos sanguíneos e as membranas fetais, e o tecido viloso foi obtido e cortado em pedaços de 1 mm3 com uma tesoura oftálmica.

3.º Adicionar 0,25% de tripsina e 0,1% de DNase I, digerir em banho-maria a 37°C com agitação suave durante 5 minutos, aspirar depois o digerido e rejeitar.

4. O tecido restante foi digerido com 0,25% de tripsina e 0,1% de DNase I em banho-maria a 37°C durante 10 minutos, a digestão foi aspirada e foi adicionado 10% de soro de vitelo para finalizar a digestão. Repita isto por 3 a 4 vezes e recolha todo o sobrenadante.

5. O sobrenadante digerido rico em trofoblastos foi filtrado através de um crivo de malha 80 e 300 mesh, o líquido filtrado foi recolhido, centrifugado a 300 g durante 10 minutos e o sobrenadante foi rejeitado.

6. Os sedimentos celulares foram ressuspensos e plaqueados num gradiente de Percoll descontínuo (10%~70%, um gradiente por 10%) e centrifugados a 1000 g durante 20 min.

7.º Absorver as células com uma camada de densidade de 40% (p = 1,048 ~ 1,062 g/ml) como trofoblastos e adicionar meio de cultura DMEM com alto teor de glicose contendo 10% de soro bovino fetal após a lavagem.

8.º Ajuste a densidade celular para 5x10/ml, plante numa placa pré-revestida com colagénio tipo IV (ou FN ou Matrigel) e incube aderentemente durante 10 minutos para remover os fibroblastos facilmente aderentes. Incubar numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2 durante 24 horas antes de mudar o meio de cultura pela primeira vez.

9. Após 24 h, o estado de crescimento das células foi observado ao microscópio de contraste de fase invertida. O EVCT pode migrar e agregar-se, mas não se funde e a capacidade proliferativa é fraca.

10. A identificação imunohistoquímica das células obtidas foi realizada com base nas características de vimentina negativa, CK7 positiva.

11. Depois de ser marcado com anticorpo de superfície anti-HLA-G, o FACSAriaII separou e purificou células trofoblásticas extravilosas de vilosidades HLA-G+ com uma pureza> 95%.

Nota

●O tecido viloso pode ser digerido com 1 mg/ml de colagenase IV e 0,1 mg/ml de DNase I, dependendo das condições laboratoriais.

●O EVCT tem uma fraca capacidade proliferativa e muitas passagens podem facilmente provocar a perda de certas características biológicas das células, pelo que é importante reduzir o número de passagens nas células cultivadas.

●EVCT e VCT expressam CK7 e não expressam vimentina, podendo ser identificados por imunohistoquímica de c-erbB-2 para distinguir entre EVCT (positivo para c-erbB-2) e VCT (negativo para c-erbB-2).