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O leitor de microplacas é um instrumento de laboratório comum amplamente usado na medição da concentração de proteínas e outros experimentos bioquímicos. Seu princípio é baseado no método de absorbância de luz, que determina a concentração da substância alvo na amostra medindo a absorbância de luz da solução da amostra em um comprimento de onda específico. Ao usar um leitor de microplacas, a proteína ou outras substâncias bioquímicas na amostra geralmente reagem com um reagente de cor específico para gerar um produto com características específicas de absorção de luz. O instrumento emite luz de um comprimento de onda específico e, após passar pela amostra, o detector mede a intensidade da luz transmitida.

Comparando a absorbância com a curva padrão, a concentração da substância alvo na amostra pode ser calculada com precisão. A curva padrão é geralmente feita de uma série de amostras padrão de concentrações conhecidas, e sua absorbância é usada para calibrar o leitor de microplacas para garantir a precisão dos resultados da medição. A alta sensibilidade e alta precisão do leitor de microplacas o tornam uma ferramenta essencial para experimentos bioquímicos, como medição de concentração de proteína, análise de atividade enzimática e experimentos de proliferação celular.

A proteína é uma biomacromolécula importante em organismos vivos, e sua determinação de conteúdo é de grande importância na pesquisa em ciências biológicas e na indústria de biotecnologia. O leitor de microplacas é um instrumento de precisão usado para detectar a concentração de biomoléculas, que analisa quantitativamente as moléculas alvo com base na mudança de cor produzida por reações catalisadas por enzimas.

Welso compartilhou o método BCA (método colorimétrico) para determinar a concentração de proteína. O princípio é que a proteína reage com íons de cobre (Cu²⁺) sob condições alcalinas para formar um complexo roxo-azulado. O complexo tem um pico de absorção característico em um comprimento de onda específico (geralmente 562 nm), e sua absorbância é linearmente proporcional à concentração de proteína na amostra. Ao medir a absorbância com um leitor de enzimas e compará-la com a curva padrão, a concentração de proteína na amostra pode ser calculada com precisão. Este método é amplamente utilizado para determinação rápida da concentração de proteína devido à sua alta sensibilidade e operação simples.

Propósito experimental 

Domine o uso de um leitor de microplacas e familiarize-se com seu processo de operação e funções.

Aprenda os princípios básicos e as etapas de operação da análise quantitativa de proteínas.

Meça a concentração de proteínas pelo método BCA e verifique a precisão dos resultados experimentais.

Materiais e instrumentos experimentais 

Materiais

Solução de proteína padrão (como albumina de soro bovino)

Amostra de solução de proteína a ser testada

Solução de BCA

Microplaca de 96 poços

Reagentes 

Sulfato de cobre

Sulfato de sódio

Hidróxido de sódio, etc.

Instrumentos 

Leitor ELISA

Balança eletrônica

Pipetadores

Banho-maria termostático

Etapas experimentais 

●Configurando curvas padrão

A. Prepare a solução de BCA de acordo com as instruções do kit.

B. Dilua a solução padrão de proteína com água deionizada para diferentes gradientes de concentração (como 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ug/mL)

C. Adicione a solução padrão diluída a cada microplaca de 96 poços, 100 μL por poço.

D. Adicione 100 μL de solução de BCA a cada poço e misture bem.

E. Coloque a microplaca em um leitor de ELISA e meça o valor de absorbância em um comprimento de onda de 562 nm

Configure uma curva padrão com a concentração de proteína como eixo horizontal e o valor de absorbância como eixo vertical

●Determinação da amostra

A. Dilua a amostra de proteína a ser testada com água deionizada até uma concentração apropriada.

B. Adicione as amostras diluídas a uma microplaca de 96 poços, 100 μL em cada poço.

C. Adicione 100 μL de solução de BCA a cada poço e misture bem.

D. Coloque a microplaca em um leitor de ELISA e meça o valor de absorbância em um comprimento de onda de 562 nm.

●Análise de resultados

Com base no valor de absorbância da amostra medida, encontre a proteína correspondente na curva padrão e, em seguida, calcule a concentração de proteína da solução da amostra com base no volume da amostra.

O método BCA é um método de análise quantitativa de proteínas comumente usado com as vantagens de operação simples, alta sensibilidade e forte especificidade. Durante o experimento, atenção especial deve ser dada à prevenção da desnaturação, degradação e contaminação de proteínas para garantir a precisão dos resultados. Os resultados deste experimento mostram que o método BCA pode determinar efetivamente a concentração de amostras de proteínas e fornecer suporte de dados confiável para pesquisas subsequentes de proteínas.

Este experimento utilizou com sucesso o instrumento ELISA e o método BCA para determinar a concentração de amostras de proteína, verificou a viabilidade do método e forneceu uma referência importante para análise quantitativa de proteínas.