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분자생물학 및 세포생물학 실험에서 핵단백질의 고순도 추출은 유전자 조절, 전사인자 활성, 크로마틴 구조와 같은 핵 과정을 연구하는 데 중요한 단계입니다. 핵단백질과 세포질 단백질의 분포 차이로 인해 실험 데이터의 정확성을 보장하기 위해 교차 오염이 적고 조작이 쉬운 핵단백질 추출 방법이 필요하여 고순도 핵단백질 샘플을 얻을 수 있습니다. 또한 핵단백질은 외부 환경에 민감하므로 추출 과정 중 온도 조절 및 프로테아제 억제제 사용과 같은 작동 조건에 특별한 주의를 기울여 단백질 활성을 유지하고 분해를 방지해야 합니다.

특히 다양한 실험적 필요에 맞는 적절한 핵단백질 추출 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 예를 들어, HIF1-α 및 TWIST와 같이 핵에서 고도로 발현되는 단백질의 경우, 핵단백질 추출 키트 또는 전용 핵단백질 용해 완충액을 사용하여 추출하는 것이 좋습니다. 이러한 방법은 작업 단계를 최적화할 뿐만 아니라 세포질과 핵단백질 간의 교차 오염을 효과적으로 줄여 후속 실험(예: Western Blot, 면역침전 등)을 위한 신뢰할 수 있는 샘플 기반을 제공합니다.

다음은 비교적 사용하기 쉬운 두 가지 핵단백질 추출 방법입니다.

HIF1-α 및 TWIST와 같이 핵에서 발현이 높은 단백질의 경우, 특수 핵단백질 추출 키트 또는 핵단백질 용해 완충액을 사용하여 추출해야 합니다.

핵단백질 추출 단계(균질화 분쇄 방법)

준비

핵단백질 추출 실험 전에 관련 시약과 완충액을 미리 준비하여 실험 과정이 순조롭게 진행되도록 해야 합니다. 다음은 Trypan Blue 염색 용액과 완충액의 자세한 공식과 사용법입니다.

Trypan Blue 염색 용액 공식

모액 준비: 적절한 양의 Trypan Blue 분말을 달아 10mL의 이중 증류수에 녹여 4%(w/v) Trypan blue 모액을 준비합니다.

작업 용액 희석: PBS 완충액을 사용하여 모액을 10배 희석하여 0.4% 농도의 작업 용액을 얻습니다.

사용법: 0.4% Trypan blue 작업 용액과 세포 현탁액을 1:1의 부피로 혼합하여 세포 계수 또는 세포 활동 검출에 사용합니다.

완충액 A 공식(세포 용해 완충액)

성분:

10 mM HEPES(pH 7.9, 4°C)

1.5 mM MgCl₂

10 mM KCl

0.5 mM DTT(디티오트레이톨)

혈장 단백질 분해가 핵 단백질에 영향을 미치는 것을 방지해야 하는 경우 1 mM PMSF(페닐메틸설포닐플루오라이드)를 추가할 수 있습니다.

기능:

세포막 용해, 세포핵 방출 및 세포핵의 무결성을 보장하는 데 사용됩니다.

완충액 B 공식(핵 단백질 추출 완충액)

성분:

20 mM HEPES(pH 7.9)

25%(v/v) 글리세롤

0.42 M NaCl

1.5 mM MgCl₂

0.2 mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)

0.5 mM PMSF

0.5 mM DTT

기능:

핵막을 파열하고 단백질의 안정성과 활성을 유지하면서 핵 단백질을 방출합니다.

핵 단백질 추출 단계

세포 수집

● 플라스크에서 세포를 분해하여 마이크로 튜브에 수집합니다.

● 4°C에서 5분 동안 300g로 원심분리하고 상층액을 폐기합니다.

● 잔류 불순물이 제거되었는지 확인하기 위해 세포 침전물을 PBS 완충액으로 3번 세척합니다.

세포 용해 준비

● 원심분리 후 상층액을 폐기합니다. 미리 냉각된 완충액 A의 5배 용량을 추가하고(예: 20 μL 세포 침전물마다 100 μL 완충액 A 추가), 피펫으로 혼합한 다음 세포를 완전히 현탁합니다.

● 세포 현탁액을 얼음 위에 10분간 둔 다음 4°C에서 300g로 5분간 원심분리합니다.

핵 방출

● 원심분리 후 상층액을 버리고 미리 냉각된 완충액 A의 25배 용량을 다시 추가하고 부드럽게 피펫으로 세포를 재현탁합니다.

● 세포 현탁액을 Dounce 균질화기에 옮겨 균질화합니다.

균질화 모니터링

● 균질화 과정에서 소량의 세포 현탁액을 취하고 동일한 용량의 0.4% 트리판 블루 염료와 섞습니다.

● 현미경으로 세포막 파열을 관찰합니다.

● 대부분 세포가 파란색으로 염색되면 세포막이 파열되었다는 의미이므로 균질화를 중단합니다.

●완전히 파열되지 않았다면 균질화를 계속합니다.

세포핵과 세포질 분리

●대부분의 세포가 파열되면 세포 현탁액을 에펜도르프 튜브로 옮기고 4°C에서 20분 동안 25,000g로 원심분리합니다.

원심분리 결과:

●상층액에는 세포질 성분이 포함되어 있습니다.

●침전물은 핵 단백질이 포함된 세포핵입니다.

핵 단백질 추출

●원심분리 후 침전물을 수거하고 미리 냉각한 완충액 B 1볼륨을 첨가한 다음 부드럽게 불어 침전물을 재현탁합니다.

●현탁액을 깨끗한 조직 균질화기에 옮기고 30회 균질화하여 핵 단백질이 완전히 방출되도록 합니다.

단백질 용해 및 추출

●균질화된 현탁액을 Eppendorf 튜브로 옮기고 얼음 위의 저속 셰이커에서 45분 동안 배양하여 핵 단백질이 완전히 용해되었는지 확인합니다.

●4°C에서 25,000g로 30분 동안 원심분리하고 정제된 핵 단백질인 상층액을 수집합니다.

핵단백질 추출 단계(키트 방법)

준비

시약 준비

●핵단백질 추출 키트를 실온으로 평형화합니다.

●혈장 단백질 추출 시약과 핵단백질 추출 시약에 PMSF를 최종 농도 1mM로 첨가합니다.

●샘플에 시스테인이 포함되어 있는 경우 두 시약에 DTT를 최종 농도 0.5mM로 첨가합니다.

세포 수집 및 세척

●플라스크 벽에서 세포를 소화하여 에펜도르프 튜브에 수집합니다.

●4°C에서 300g로 5분간 원심분리하고 상층액을 버립니다.

●잔류 불순물을 제거하기 위해 PBS 완충액으로 세포를 1~2회 세척합니다.

세포 용해

●4°C에서 300g로 10분간 원심분리하고 상층액을 버립니다.

● 혈장 단백질 추출 시약 5배를 넣고(예: 20 μL 세포 펠릿당 100 μL 추가) 뒤집어서 부드럽게 섞어서 세포가 고르게 현탁되도록 합니다. 과도한 세포 파괴를 방지하기 위해 소용돌이를 피하도록 주의하세요.

용해 반응

● 세포 현탁액을 얼음 위에 20분간 두어 세포를 완전히 용해합니다.

세포질 단백질 분리

● 4°C에서 250g로 20분간 원심분리하고 상층액을 버립니다.

● 미리 냉각된 혈장 단백질 추출 시약 2배를 세포 펠릿에 넣고 부드럽게 섞습니다.

핵 방출

● 0.14mm 바늘이 달린 주사기를 사용하여 5회 부드럽게 불어서 세포 펠릿을 완전히 용해합니다.

● 4°C에서 10,000g로 30분간 원심분리하고 상층액(세포질 단백질)을 수집하고 펠릿(핵 단백질)을 버립니다.

핵단백질 추출

●핵단백질 침전물에 핵단백질 추출 시약 50-100 μL를 넣고 0.14 mm 직경 바늘 주사기로 5번 가볍게 불어 침전물이 완전히 현탁되도록 합니다.

●현탁액을 얼음 위의 저속 셰이커에 놓고 45분 동안 배양하여 핵단백질의 용해를 촉진합니다.

핵단백질 분리

●4°C에서 16,000 g로 5분 동안 원심분리하고 추출된 세포 핵단백질인 상층액을 수집합니다.

조직 핵 단백질 추출 단계

조직 샘플 준비

●추출할 조직 샘플의 무게를 측정합니다.

●균질화 효율을 높이기 위해 조직을 가능한 한 작은 조각으로 자릅니다.

조직 균질화

●조직 50mg마다 300-500 μL PBS를 추가합니다.

●균질화기를 사용하여 얼음 욕조 조건에서 완전히 균질화하여 조직이 완전히 분리되고 균일한 현탁액을 형성하도록 합니다.

원심분리 및 침전물 수집

●4°C에서 3분 동안 500g로 원심분리하고 조직 현탁액의 상층액을 버립니다.

●세포와 세포소기관이 포함된 침전물을 수집합니다.

세포 핵 추출

●수집한 침전물을 200 μL 혈장 단백질 추출 용액에 추가합니다.

●위의 원심분리 단계에 따라 세포 핵 단백질을 계속 추출합니다.

적절한 방법의 선택은 실험 목적, 샘플 크기, 실험 장비에 따라 결정되어야 합니다. 실제 응용 분야에서 연구자는 자신의 필요와 샘플의 특정 특성에 따라 적절한 핵 단백질 추출 방법을 유연하게 선택할 수 있습니다. 어떤 방법을 선택하든, 작업의 정확성과 낮은 온도 조건을 보장하는 것이 고품질 핵 단백질을 얻는 데 중요합니다.

이 글이 모든 사람에게 귀중한 참고 자료를 제공하고, 핵단백질 추출 과정을 최적화하고, 실험의 신뢰성과 반복성을 향상시키는 데 도움이 되기를 바랍니다.