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ELISA(효소결합면역흡착검사)는 항원과 항체의 특이적 결합을 기반으로 하는 면역검정 기술입니다. 기본 원리는 물리적 흡착을 통해 폴리스티렌 마이크로플레이트 표면에 특정 농도의 항원 또는 항체를 고정한 다음 검사할 샘플을 첨가하고 효소 라벨과 기질 사이의 반응으로 생성되는 발색 정도를 사용하여 검사할 항원 또는 항체의 존재 또는 부재 또는 양을 간접적으로 반영하는 것입니다.

ELISA 기술은 면역 표지 기술의 한 유형(면역 형광 기술, 면역 방사 측정 기술, 면역 효소 기술 및 면역 콜로이드 금 기술 포함)으로, 빠르고 민감하며 정성적 또는 정량적 검출이라는 특성으로 인해 과학 연구 및 임상 실험에 널리 사용되었습니다.

ELISA는 분자생물학, 면역학, 세포생물학 연구에서 일반적으로 사용되는 실험 방법 중 하나이지만, 실제 운영에서 사람들은 종종 다양한 실험적 어려움에 직면합니다. 예를 들어, ELISA 실험에서 높은 블랭킹은 일반적인 문제 중 하나이며, 이는 실험 결과의 정확성에 영향을 미칠 뿐만 아니라 데이터의 신뢰성을 방해할 수도 있습니다. 따라서 높은 블랭킹의 이유를 깊이 이해하고 효과적인 최적화 조치를 취하는 것이 특히 중요합니다.

높은 블랭킹은 ELISA 실험에서 음성 대조군 또는 블랭크의 흡광도 값이 비정상적으로 증가하는 것을 말합니다. 일반적으로 음성 웰의 흡광도 값은 0.1 미만이어야 합니다. 배경 값이 너무 높으면 실험 결과에 영향을 미치고 데이터의 정확도와 신뢰성이 떨어지며 샘플에서 항원 또는 항체의 실제 함량을 정확하게 평가할 수 없게 됩니다.

일반적인 원인은 다음과 같습니다.

● 플레이트가 깨끗하지 않음

해결책:

▼철저히 세척

세척 시간이 충분하지 않으면 항체 잔류물이 발생하여 음성 대조군이 착색됩니다.

세척 시간을 늘리고 세척 횟수를 늘리고 세척 용액에 적절한 양의 계면활성제(예: 트윈-20, 0.05%)를 첨가해 보세요.

각 단계에서 플레이트를 세척할 때는 세척이 철저해야 하며 웰에 뚜렷한 잔여 액체가 없을 때까지 플레이트를 철저히 두드려 주세요.

▼교차 오염을 피하십시오

세척 용액을 폐기하거나 항체를 배양할 때는 웰 간 교차 오염을 피하도록 주의하십시오.

반복 사용으로 인한 오염을 방지하기 위해 피펫 팁은 가능한 한 한 번만 사용해야 합니다.

플레이트를 두드릴 때 사용한 여과지는 2차 오염을 방지하기 위해 재사용해서는 안 됩니다.

● 항체 또는 시약 농도가 너무 높음

이유: 항체, 효소 표지된 2차 항체 또는 발색 기질의 농도가 너무 높아 비특이적 반응이 증가하고 배경 신호가 증가합니다.

해결책:

▼항체 농도 최적화: 과다 복용을 피하기 위해 항체를 적절한 작업 농도로 희석합니다.

▼시약 농도 제어: 과도한 농도를 방지하기 위해 효소 표지된 2차 항체와 발색 기질의 농도를 엄격히 조절합니다.

▼그래디언트 희석 실험 수행: 각 시약의 최적 농도를 결정하고 블랭킹 간섭을 줄이기 위해 예비 실험을 통해 점진적으로 희석합니다.

● 불완전 차단

이유: 차단 용액(BSA 등)이 항체와 교차 반응하여 배경 신호가 증가할 수 있습니다. 차단 용액 농도가 너무 낮거나 차단 시간이 너무 짧으면 차단이 완료되지 않아 항체가 ELISA 플레이트에 비특이적으로 결합되어 배경 값이 증가할 수 있습니다.

해결책:

▼적절한 차단 용액을 사용하고 차단 용액의 농도를 조정합니다.

▼차단 시간은 충분해야 하며 일반적으로 1~2시간(실온) 또는 4°C에서 밤새도록 두어야 합니다.

▼차단 후 플레이트 웰을 씻어 과도한 차단 용액을 제거해야 합니다.

●색 반응이 너무 길다

이유: 시스템 최적화가 부적절하여 샘플 색 반응이 약하다. 이러한 결함을 보완하기 위해 색 반응 시간을 늘린다. 색 반응 시간이 길면 기질의 비특이적 반응이 증가한다.

해결책:

▼ 검출 시스템을 최적화하고 코팅, 검출 항체 및 기질의 농도를 조절하여 민감하고 특정적인 반응을 보장해야 한다.

▼ 일반적으로 15분 이내로 색 반응 시간을 줄여 실험 결과의 정확성을 보장하고 블랭킹 간섭을 피한다.

● 시약 오염 또는 저하

이유: 시약 및 완충액의 제조 또는 보관 중에 오염이 발생하여 블랭킹이 증가할 수 있습니다.

해결책:

▼ 교차 오염을 피하기 위해 신선하게 준비된 시약을 사용하십시오.

▼ 시약 순도를 보장하기 위해 여과된 용액을 사용하십시오.

▼ 항체, 기질, 세척 용액 및 완충액의 유효 기간을 확인하여 손상된 시약을 사용하지 않도록 하십시오.

● 온도 및 환경 요인

이유: 너무 높은 온도 또는 높은 습도는 비특이적 반응을 강화시켜 블랭킹이 증가합니다.

해결책:

▼ 인큐베이터를 확인하여 인큐베이션 온도가 37°C로 안정적인지 확인하고 지침에 나와 있는 반응 시간에 따라 인큐베이션합니다.

▼ 플레이트 웰을 장시간 고온이나 강한 빛에 노출시키지 마십시오.

기구와 장비는 ELISA 실험의 성공의 기초입니다. 일반적으로 사용되는 관련 장비에는 피펫, 마이크로플레이트 리더, 플레이트 세척기 및 인큐베이터가 있습니다. 모든 장비는 정확성과 정밀성을 보장하기 위해 정기적으로 검사하고 교정해야 합니다. Welso는 다양한 ELISA 실험에 필요한 고품질 장비를 제공합니다. 자세한 내용은 문의해 주시기 바랍니다.