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태반세포 기능을 가진 세포는 태반세포라고 하며, 태반세포는 배아 외부의 태반세포에서 유래하며 정상적인 임신에서 중요한 연결 고리입니다. 배아 이식 후 태반세포는 분열, 다형성, 분화하여 EVCT와 융모세포태반세포(VCT)를 형성하는데, 생물학적 특성이 확연히 다릅니다.

인간 융모외융모세포를 분리하고 배양하는 기본 원리는 EVCT가 침습 능력을 가지고 있고, 자궁 탈락막의 깊은 부분에 모여 섬을 형성하며, 자궁 탈락막 세포와 가장 밀접하게 접촉하고 있다는 것입니다. 이는 모체와 태아의 면역 미세 환경의 중요한 부분입니다.

융모조직을 탈락막으로부터 선별하여 효소소화 여과 후 분쇄, 여과하고, 밀도구배원심분리하여 세포의 밀도에 따라 40% 밀도층을 흡수시켜 영양막세포를 얻었고, EVCT를 다른 시간에 단기간 배양하여 추가로 정제하였다.

세포의 형태, 표현형 및 기능적 특성에 따라 면역조직화학법이나 형광 항체를 통해 세포를 식별, 분리 및 정제하고, 동시에 흐름 세포 분석법을 통해 세포 표면 항원을 표지하여 영양막 세포의 생물학적 기능에 대한 심층적인 논의를 위한 기반을 마련했습니다.

시약 및 기구

시약:

PBS 용액, D-Hanks 용액, RBC 용해물

DMEM/F12 배양 배지, 태아우혈청, 트립신

콜라게나아제 4형, DNase 1형, 피브로넥틴(FN)

4형 콜라겐, 마트리젤, 퍼콜 스톡 용액, 항생제

기구:

안과용 가위, 핀셋, 다양한 크기의 스크린(80메시, 300메시)

모든 종류의 페트리 접시, 주사기 손잡이, 다양한 사양의 플라스틱 원심분리 튜브

1.5ml EP 튜브, 피펫, Welso WLR600 탁상형 저속 냉장 원심분리기

자석극 및 비드 분류 컬럼, CO2 인큐베이터, 수조 셰이커, 유세포 분석기

실험 절차

인간 융모외융모세포의 분리 및 배양을 위한 기본 단계는 다음과 같은 단계로 나눌 수 있습니다.

1. 시약 준비

(1) IV형 콜라겐 용액: IV형 콜라겐을 0.25% 빙초산에 녹인 후 4°C에서 밤새 완전히 녹여 최종 농도가 2.0mg/ml가 되도록 합니다. 사용 시, 플레이트는 6~10μg/c㎡로 충진하고 4°C에서 밤새도록 두었습니다. IV형 콜라겐으로 코팅된 세포 배양 플레이트는 UV 조사로 밤새도록 살균하거나 75% 에탄올로 헹굴 수 있습니다.

(2) FN 용액: FN 건조 분말 1mg을 멸균 증류수 1ml에 녹인 후 실온에서 30분간 방치하여 자연적으로 녹인 후 농도가 1mg/ml이 되도록 보관합니다. 20μl/튜브에 분주하여 -70°C에서 보관합니다.

(3) FN용액 20 μl를 FD배지 1 ml에 녹인 후(농도 20 μg/ml) 직경 35 mm 페트리접시에 붓고 실온에서 45분간 배양한 후 배지를 버린다.

메모:

즉시 코팅된 페트리 접시는 -20°C에서 보관하거나 사용할 수 있지만 2주를 넘지 않아야 합니다.

2. 신선한 탈락막 조직을 1x PBS로 3번 세척하여 혈전과 태아막을 제거한 후 융모 조직을 채취하여 안과 가위로 1mm 3조각으로 잘랐다.

3. 0.25% 트립신과 0.1% DNase I을 첨가하고 37°C 수조에서 5분간 가볍게 흔들어 주면서 소화한 후, 소화물을 흡인하여 버립니다.

4. 남은 조직은 37°C의 수조에서 0.25% 트립신과 0.1% DNase I로 10분간 소화하고, 소화물을 흡인한 후 10% 송아지 혈청을 첨가하여 소화를 종결합니다. 이를 3~4회 반복하고 상층액을 모두 수거합니다.

5. 영양막세포가 풍부한 소화 상층액을 80메시와 300메시 체로 차례로 여과하고, 여과된 액을 모아 300g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버렸다.

6. 세포 펠릿을 재부유시키고 불연속 Percoll 기울기(10%~70%, 10%당 기울기 1개)에 도말한 후 1000g에서 20분간 원심분리했습니다.

7. 흡수세포를 40% 밀도층(p=1.048~1.062 g/ml)으로 영양막세포로 하고 세척 후 10% 태아우시혈청이 포함된 DMEM 고포도당 배양배지를 첨가한다.

8. 세포 밀도를 5x10/ml로 조정하고, 미리 코팅된 IV형 콜라겐(또는 FN 또는 Matrigel) 코팅된 플레이트에 심고, 쉽게 부착되는 섬유아세포를 제거하기 위해 10분간 부착 상태로 배양합니다. 처음으로 배양 배지를 바꾸기 전에 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양합니다.

9. 24시간 후 역위상차현미경으로 세포의 성장 상태를 관찰하였다. EVCT는 이동하고 응집할 수 있지만 융합하지 않으며 증식 능력이 약하다.

10. 얻어진 세포의 면역조직화학적 확인은 비멘틴 음성, CK7 양성의 특성을 바탕으로 시행하였다.

11. FACSAriaII는 항-HLA-G 표면 항체로 표지한 후, 순도 95% 이상인 HLA-G+ 융모외융모세포를 분류하고 정제했습니다.

참고

●융모 조직은 실험실 조건에 따라 1mg/ml 콜라겐 분해효소 IV와 0.1mg/ml DNase I로 소화될 수 있습니다.

●EVCT는 증식 능력이 약하고, 너무 많은 계대는 세포의 특정 생물학적 특성을 쉽게 잃을 수 있으므로 배양된 세포에서 계대 횟수를 줄이는 것이 중요합니다.

●EVCT와 VCT는 모두 CK7을 발현하고 비멘틴을 발현하지 않으며, c-erbB-2 면역조직화학법으로 EVCT(c-erbB-2에 대해 양성)와 VCT(c-erbB-2에 대해 음성)를 구별할 수 있습니다.