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マクロファージは体内の免疫システムにとって極めて重要であり、病原体の貪食、免疫反応の調節、組織の恒常性の維持に重要な役割を果たしています。一次抽出法によって、研究者は細胞株の複数回の継代によって引き起こされる可能性のある遺伝的変化や機能低下を回避し、生体から完全な生物学的活性を備えたマクロファージを直接取得して、その後の実験のための強固な基盤を築くことができます。

一次骨髄由来マクロファージは、刺激を受けていないときは通常円形または楕円形で、細胞サイズはさまざまで、核は小さく、ほとんどが円形または楕円形で、クロマチンはゆるく、核小体は明らかです。細胞質には液胞や顆粒状物質がよく見られ、これらの構造は貪食機能と密接に関係しています。

遠心分離機は、BMDM 細胞抽出プロセスにおいて重要な役割を果たします。遠心分離ステップにより、細胞を効果的に分離して沈殿させ、高品質の骨髄マクロファージを得ることができます。遠心分離プロセスは、不純物の除去に役立つだけでなく、細胞の純度と活性を確保し、抽出プロセスに不可欠な重要なリンクとなります。

マウスを例にとった一次マクロファージ抽出法の詳細な手順と注意事項は次のとおりです。

実験材料の準備

実験動物: C57BL/J マウス

試薬: 10% FBS、75% エタノール、滅菌 PBS を含む DMEM 高グルコース培地。

実験器具: 使い捨て注射器、手術器具、遠心管、遠心分離機、細胞培養プレートまたは培養フラスコなど。

実験手順

●麻酔と殺処分：マウスを麻酔した後、動物実験の倫理に従い、マウスの痛みを最小限に抑えるために、脱臼により迅速かつ人道的に殺処分しました。

●表面消毒：75％エタノールが入ったビーカーにマウスを5分間浸します。徹底的に消毒した後、清潔なペーパータオルを使用して余分なアルコールを吸収します。

●皮膚と関節の処理：滅菌したハサミを使用してマウスの背中に小さな切開を入れ、素手でふくらはぎの関節まで皮膚を引き裂き、足の関節と皮膚を取り除きます。

●脚のサンプリングと二次消毒：骨折を避けるために、滅菌したハサミを使用して、大腿部の付け根にある大転子から後肢を慎重に分解します。筋肉を取り除いた後、脚の骨を75％エタノール培養皿に5分間浸します。

●5分後、エタノール培養皿から脚の骨を取り出し、新しいエタノール培養皿に移し、クリーンベンチに移して、その後の実験のための無菌環境を整えます。

BMDM 細胞抽出および誘導

● 脚骨の前処理: エタノールに浸したマウスの脚骨を冷たい PBS が入った容器に移し、骨表面のエタノールを PBS で完全に浸してすすぎ、これを 3 回繰り返して完全に洗浄します。

● 骨髄抽出: 洗浄した大腿骨と脛骨を分離し、滅菌したハサミで両端を切ります。1mL の注射器を使用して冷たい誘導培地を吸収し、骨の端を狙って骨髄を吹き飛ばします。脚骨に明らかな赤い骨髄の残留物がなくなるまで、約 3 回吹き飛ばして洗浄を繰り返します。

● 細胞分散および濾過: 5mL ピペットを使用して、骨髄細胞を含む培地を静かに吹き飛ばして、細胞塊を分散させます。懸濁液を 70μm の細胞フィルターで濾過して不純物を取り除き、濾液を 15mL の遠心管に移します。

● 遠心分離と再懸濁：1500rpmで5分間遠心分離し、上清を捨てます。赤血球溶解緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、5分間放置した後、同じ速度で5分間遠心分離し、上清を捨てます。最後に、細胞ペレットを冷たい誘導培地で再懸濁します。

● 細胞培養と培地交換：必要に応じて細胞を播種します。3日目には、安定した培養環境を維持するために培地の半分を交換しました。5日目には、細胞の成長と分化のニーズを満たすために、新鮮な培地を全量交換しました。7日目には、細胞は使用可能な状態になりました。

注意事項

●BMDM 細胞は継代できません: BMDM 細胞は特殊な生物学的特性を持つため、継代操作には適していません。

●トリプシン消化は避けてください: トリプシンは接着細胞の分離によく使用されますが、BMDM 細胞には適していません。トリプシンのタンパク質分解活性により細胞膜と主要タンパク質が破壊され、細胞が不活性化し、その後の実験に使用できなくなります。したがって、BMDM 細胞を処理するためにトリプシンを使用しないでください。

●セルスクレーパーの使用をお勧めします: 継代とトリプシン消化の制限のため、セルスクレーパーを使用して BMDM 細胞を優しくこすり取ることをお勧めします。

●培養容器の頻繁な変更は避けてください: BMDM 細胞は壊れやすく、環境に敏感です。取得後、実験のために直接プレーティングすることをお勧めします。培養容器を頻繁に変更すると、物理的な障害が発生し、細胞の衝突や引っ張りが発生し、細胞が損傷して実験結果に支障をきたす可能性があります。

上記は、ユーザーに役立つ BMDM 細胞抽出の詳細なプロセスです。生物学的実験では、Welso は必要なすべての実験機器を提供できます。特に、当社の遠心分離機シリーズは実験に欠かせないアシスタントであることは注目に値します。当社は、低速遠心分離機、高速遠心分離機、冷蔵遠心分離機、ミニ遠心分離機、大容量床置き遠心分離機など、世界中のお客様に高品質の遠心分離機製品を提供することに重点を置いています。当社の製品にご興味がございましたら、お早めにご連絡ください。最適な見積もりをお送りします。