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分子生物学および細胞生物学の実験において、高純度の核タンパク質の抽出は、遺伝子制御、転写因子の活性、クロマチンの構造などの核プロセスの研究における基本的なステップです。核タンパク質と細胞質タンパク質の分布の違いにより、実験データの正確性を確保するには、高純度の核タンパク質サンプルを得るためにクロスコンタミネーションが少なく、操作が簡単な核タンパク質抽出法が必要です。さらに、核タンパク質は外部環境の影響を受けやすいため、タンパク質の活性を維持し分解を防ぐために、温度制御やプロテアーゼ阻害剤の使用など、抽出プロセス中の操作条件に特別な注意を払う必要があります。

さまざまな実験ニーズに応じて、適切な核タンパク質抽出方法を選択することが特に重要です。例えば、HIF1-αやTWISTなど核内で高発現しているタンパク質の場合は、核タンパク質抽出キットや専用の核タンパク質溶解バッファーを使用して抽出することをお勧めします。これらの方法は、操作ステップを最適化するだけでなく、細胞質と核タンパク質の間の相互汚染を効果的に低減し、その後の実験（ウェスタンブロット、免疫沈降など）のための信頼できるサンプリングベースを提供します。

ここでは、比較的使いやすい 2 つの核タンパク質抽出方法を紹介します。

HIF1-αやTWISTなど核内で高発現しているタンパク質の場合は、専用の核タンパク質抽出キットや核タンパク質溶解バッファーを使用して抽出する必要があります。

核タンパク質抽出工程（均質化粉砕法）

準備

核タンパク質抽出実験の前に、実験プロセスがスムーズに行われるように、関連する試薬とバッファーを事前に準備する必要があります。以下は、トリパン ブルー色素と緩衝液の詳細な配合と使用法です。

トリパンブルー色素溶液の配合

原液の調製: 適切な量のトリパンブルー粉末を秤量し、10 mL の再蒸留水に溶解して 4% (w/v) トリパンブルー原液を調製します。

作業溶液の希釈: PBS バッファーを使用してストック溶液を 10 倍に希釈し、濃度 0.4% の作業溶液を取得します。

使用法: 細胞計数または細胞活動の検出には、0.4% トリパン ブルー作業溶液と細胞懸濁液を 1:1 の量で混合します。

バッファー A フォーミュラ (細胞溶解バッファー)

材料：

10 mM HEPES (pH 7.9、4℃)

1.5 mM MgCl₂

10mM KCl

DTT 0.5 mM (ジチオスレイトール)

血漿タンパク質の分解が核タンパク質に影響を与えるのを防ぐ必要がある場合は、1 mM PMSF (フッ化フェニルメチルスルホニル) を追加できます。

関数：

細胞膜を溶解し、細胞核を放出し、細胞核の完全性を保証するために使用されます。

バッファー B フォーミュラ (核タンパク質抽出バッファー)

材料：

20 mM HEPES (pH 7.9)

25% (v/v) グリセロール

0.42M NaCl

1.5 mM MgCl₂

0.2mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）

PMSF 0.5mM

TDT 0.5mM

関数：

核膜を破壊して核タンパク質を放出し、タンパク質の安定性と活性を維持します。

核タンパク質の抽出手順

細胞採取

●フラスコ内の細胞を消化し、マイクロチューブに回収します。

● 4℃、300 g で 5 分間遠心分離し、上清を捨てます。

● 細胞沈殿を PBS バッファーで 3 回洗浄し、残留不純物が確実に除去されるようにします。

細胞溶解の準備

● 遠心分離後、上清を捨ててください。 5 倍量の予冷したバッファー A を加え（たとえば、細胞沈殿 20 μL ごとにバッファー A 100 μL を加えます）、ピペットで混合し、細胞を完全に懸濁します。

● 細胞懸濁液を氷上に 10 分間置き、その後 4℃、300 g で 5 分間遠心分離します。

コアリリース

● 遠心分離後、上清を捨て、25 倍量の予冷したバッファー A を再度加え、静かにピペッティングして細胞を再懸濁します。

● 均質化のために細胞懸濁液をダウンスホモジナイザーに移します。

均質化モニタリング

● 均質化プロセス中に、少量の細胞懸濁液を採取し、等量の 0.4% トリパン ブルー色素と混合します。

●細胞膜の破れを顕微鏡で観察します。

●大部分の細胞が青く染まった場合は、細胞膜が破れて均質化が停止したことを意味します。

●完全に砕けていない場合は、均質化を続けてください。

細胞核と細胞質の分離

●大部分の細胞が破裂したら、細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、25,000 g、20 分間、4℃で遠心分離します。

遠心分離の結果:

●上清には細胞質成分が含まれています。

●沈殿物は細胞の核であり、核タンパク質が含まれています。

核タンパク質の抽出

●遠心分離後の沈殿を回収し、1 倍量のあらかじめ冷却したバッファー B を加え、軽く吹きかけて沈殿を再懸濁します。

●懸濁液を清潔な組織ホモジナイザーに移し、核タンパク質が完全に放出されるように 30 回混合します。

タンパク質の溶解と抽出

●ホモジナイズした懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、氷を入れた低速シェーカー上で45分間インキュベートし、核タンパク質が完全に溶解するようにします。

●4℃、25,000 gで30分間遠心分離し、精製された核タンパク質である上清を回収します。

核タンパク質抽出手順（キット法）

準備

試薬の準備

●核タンパク質抽出キットは室温で平衡化してください。

●血漿タンパク質抽出試薬および核タンパク質抽出試薬にPMSFを終濃度1mMになるように添加します。

●サンプルにシステインが含まれる場合は、両試薬に最終濃度 0.5 mM になるように DTT を添加します。

細胞の採取と洗浄

●フラスコ壁から細胞を消化し、エッペンドルフチューブに回収します。

●4℃、300gで5分間遠心し、上清を捨てます。

●細胞をPBS緩衝液で1〜2回洗浄し、残留不純物を除去します。

細胞溶解

● 4℃、300 g で 10 分間遠心分離し、上清を捨てます。

● 5 倍量の血漿タンパク質抽出試薬を加え（例、20 μL の細胞ペレットあたり 100 μL を加えます）、細胞が均一に懸濁していることを確認するために反転させて穏やかに混合します。過度の細胞破壊を避けるため、ボルテックスを避けるように注意してください。

溶解反応

● 細胞懸濁液を氷上に 20 分間置き、細胞を完全に溶解します。

細胞質タンパク質の分離

● 250 g、4℃で 20 分間遠心分離し、上清を捨てます。

● 2 倍量の予冷した血漿タンパク質抽出試薬を細胞ペレットに加え、穏やかに混合します。

核の解放

● 0.14 mm の針が付いたシリンジを使用して 5 回軽く吹き込み、細胞沈殿物を完全に溶解します。

● 4℃、10,000 gで30分間遠心分離し、上清（細胞質タンパク質）を回収し、沈殿物（核タンパク質）を廃棄します。

核タンパク質の抽出

●核タンパク質沈殿に核タンパク質抽出試薬 50 ～ 100 μL を加え、直径 0.14 mm の注射針で軽く 5 回吹き込み、沈殿が完全に懸濁するようにします。

●懸濁液を氷の入った低速シェーカーに置き、核タンパク質の溶解を促進するために45分間インキュベートします。

核タンパク質の分離

●4℃、16,000gで5分間遠心分離し、抽出された細胞核タンパク質である上清を回収します。

組織核タンパク質の抽出手順

組織サンプルの準備

●採取する組織サンプルの重量を測定します。

●組織をできるだけ小さく切ることで、均質化効率を高めます。

組織の均質化

●組織50mgあたりPBSを300〜500μL添加します。

●ホモジナイザーを使用して氷浴条件下で完全に均質化し、組織が完全に解離し、均一な懸濁液を形成するようにします。

遠心分離と沈殿物の収集

●4℃、500gで3分間遠心分離し、上清を廃棄して組織懸濁液として使用します。

●細胞や細胞小器官を含む沈殿を回収します。

細胞核抽出

●採取した沈殿を血漿タンパク質抽出液200μLに加えます。

●上記の遠心分離手順に従って細胞核タンパク質の抽出を続けます。

適切な方法の選択は、実験の目的、サンプルサイズ、実験装置に基づいて決定する必要があります。実際の応用では、研究者は自分のニーズと特定のサンプルの特性に基づいて、適切な核タンパク質抽出方法を柔軟に選択できます。どの方法を選択する場合でも、操作の精度と低温条件を確保することが、高品質の核タンパク質を取得するための鍵となります。

この記事が皆様にとって貴重な参考となり、核タンパク質抽出プロセスの最適化に役立ち、実験の信頼性と再現性が向上することを願っています。