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ELISA（酵素免疫測定法）は、抗原と抗体の特異的結合に基づく免疫測定技術です。その基本原理は、特定の濃度の抗原または抗体をポリスチレンマイクロプレートの表面に物理的吸着によって固定し、次に検査するサンプルを添加し、酵素標識と基質との反応によって生じる発色の程度を利用して、検査する抗原または抗体の有無または量を間接的に反映することです。

ELISA 技術は、免疫標識技術（免疫蛍光技術、免疫放射測定技術、免疫酵素技術、免疫コロイド金技術を含む）の一種であり、迅速、高感度、定性的または定量的な検出という特徴があるため、科学研究や臨床実験で広く使用されています。

ELISAは分子生物学、免疫学、細胞生物学の研究でよく使われる実験方法の1つですが、実際の操作ではさまざまな実験上の困難に遭遇することがよくあります。たとえば、ELISA実験では、高いブランキングが一般的な問題の1つであり、実験結果の精度に影響を与えるだけでなく、データの信頼性にも影響を与える可能性があります。したがって、高いブランキングの原因を深く理解し、効果的な最適化対策を講じることが特に重要です。

ハイブランキングとは、ELISA 実験におけるネガティブコントロールまたはブランクの吸光度値の異常な増加を指します。通常、ネガティブウェルの吸光度値は 0.1 未満である必要があります。バックグラウンド値が高すぎると、実験結果に干渉し、データの精度と信頼性が低下し、サンプル内の抗原または抗体の実際の含有量を正確に評価できなくなります。

Common causes include:

● Plate is not clean

一般的な原因は次のとおりです:

● プレートがきれいでない

解決策:

▼十分に洗浄する

洗浄時間が不十分だと抗体が残留し、ネガティブコントロールが着色します。

洗浄時間を延長し、洗浄回数を増やし、洗浄液に適切な量の界面活性剤 (Tween-20、0.05%) を加えてみてください。

各ステップでプレートを洗浄するときは、洗浄が徹底されていることを確認し、ウェルに明らかな残留液がなくなるまでプレートを徹底的に叩いてください。

▼交差汚染を避ける

洗浄液を廃棄したり抗体をインキュベートしたりするときは、ウェル間の交差汚染を避けるように注意してください。

ピペットチップは、繰り返し使用による汚染を防ぐため、できるだけ1回使用してください。

プレートを叩くときに使用するろ紙は、二次汚染を避けるため再利用しないでください。

●抗体または試薬の濃度が高すぎる

理由：抗体、酵素標識二次抗体、または発色基質の濃度が高すぎるため、非特異的反応が増加し、バックグラウンド信号が増加します。

解決策：

▼抗体濃度の最適化：抗体を適切な作業濃度に希釈して、過剰投与を回避します。

▼試薬濃度の制御：酵素標識二次抗体と発色基質の濃度を厳密に調整して、過剰な濃度を防ぎます。

▼勾配希釈実験の実行：予備実験を通じて徐々に希釈して、各試薬の最適濃度を決定し、ブランク干渉を減らします。

● ブロッキングが不完全

理由: ブロッキング溶液 (BSA など) が抗体と交差反応を起こし、バックグラウンド シグナルが増加する可能性があります。ブロッキング溶液の濃度が低すぎるか、ブロッキング時間が短すぎると、ブロッキングが不完全となり、抗体が ELISA プレートに非特異的に結合し、バックグラウンド値が増加する可能性があります。

解決策:

▼適切なブロッキング溶液を使用し、ブロッキング溶液の濃度を調整します。

▼ブロッキング時間は十分で、通常は 1 ～ 2 時間 (室温) または 4°C で一晩です。

▼ブロッキング後は、余分なブロッキング溶液を除去するために、必ずプレートのウェルを洗浄してください。

●色反応が長すぎる

理由: システムの最適化が適切でないため、サンプルの色反応が弱いです。この欠点を補うために、色反応時間が延長されます。色反応時間が長いと、基質の非特異的反応が増加します。

解決策:

▼検出システムを最適化し、コーティング、検出抗体、基質の濃度を調整して、感度と特異性を確保する必要があります。

▼実験結果の精度を確保し、ブランク干渉を回避するために、色反応時間を短縮します (通常は 15 分以内)。

●試薬の汚染または劣化

理由: 試薬やバッファーの準備または保管中に汚染が発生し、ブランクが増加する可能性があります。

解決策:

▼ 交差汚染を回避するために、新しく調製した試薬を使用します。

▼ 試薬の純度を確保するために、ろ過した溶液を使用します。

▼ 劣化した試薬を使用しないように、抗体、基質、洗浄液、バッファーの有効期限を確認します。

● 温度と環境要因

理由: 温度が高すぎたり湿度が高すぎたりすると、非特異的反応が強化され、ブランクが増加する可能性があります。

解決策:

▼ インキュベーターをチェックして、インキュベーション温度が 37°C で安定していることを確認し、説明書の反応時間に従ってインキュベートします。

▼ プレートウェルを高温や強い光に長時間さらさないでください。

ELISA 実験を成功させるには、器具と装置が基礎となります。一般的に使用される関連装置には、ピペット、マイクロプレート リーダー、プレート ウォッシャー、インキュベーターなどがあります。すべての装置は、正確さと精度を確保するために定期的に検査および校正する必要があります。Welso は、さまざまな ELISA 実験に必要な高品質の装置を提供しています。詳細については、お気軽にお問い合わせください。