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栄養芽細胞機能を持つ細胞は栄養芽細胞と呼ばれ、胚の外側の栄養芽細胞から発生し、正常な妊娠の重要なリンクです。胚着床後、栄養芽細胞は分裂、増殖、分化して、明確に異なる生物学的特性を持つ EVCT と絨毛細胞栄養芽細胞 (VCT) を形成します。

ヒト絨毛絨毛外栄養芽細胞の分離と培養の基本原理は、EVCT が侵入能力を持ち、子宮脱落膜の深部に凝集して島を形成し、母体と胎児の免疫微小環境の重要な部分である子宮脱落膜細胞と最も密接に接触しているという点です。

脱落膜から絨毛組織を選別し、酵素消化、粉砕、濾過を行い、密度勾配遠心分離を行い、細胞密度に応じて40%密度層を吸収して栄養膜細胞を取得し、異なる時間での短期培養によりEVCTをさらに精製した。

細胞の形態、表現型、機能特性に応じて、細胞は免疫組織化学またはフローサイトメトリー分類用の細胞表面抗原を同時に標識する蛍光抗体によって識別、分離、精製され、栄養膜の生物学的機能に関する詳細な議論の基礎となります。

試薬と機器

試薬：

PBS 溶液、D-Hanks 溶液、赤血球溶解液

DMEM/F12 培養培地、ウシ胎児血清、トリプシン

コラーゲナーゼ タイプ IV、DNase タイプ I、フィブロネクチン (FN)

タイプ IV コラーゲン、マトリゲル、パーコール ストック溶液、抗生物質

楽器：

眼科用ハサミ、ピンセット、さまざまなサイズのスクリーン（80 メッシュ、300 メッシュ）

あらゆる種類のペトリ皿、注射器ハンドル、さまざまな仕様のプラスチック製遠心管

1.5mL EP チューブ、ピペット、Welso WLR600 卓上低速冷却遠心分離機

磁極およびビーズ選別カラム、CO2 インキュベーター、ウォーターバス シェーカー、フローサイトメーター

実験手順

ヒト絨毛絨毛外栄養芽細胞の分離と培養の基本手順は、以下の手順に分けられます。

1. 試薬の調製

(1) IV型コラーゲン溶液: IV型コラーゲンを0.25%氷酢酸で溶解し、4℃で一晩完全に溶解して、最終濃度を2.0 mg/mlにします。使用時には、プレートを6~10 μg/c㎡でパックし、4℃で一晩置きます。IV型コラーゲンでコーティングした細胞培養プレートは、UV照射で一晩滅菌するか、75%エタノールでリンスすることができます。

(2) FN溶液: FN乾燥粉末1 mgを滅菌蒸留水1 mlに溶解し、室温で30分間放置して自然に溶解し、1 mg/mlの濃度で保存します。20 μl/チューブに分注し、-70℃で保存します。

（３）FN溶液20μlをFD培地1ml（濃度20μg/ml）に溶解し、直径35mmのペトリ皿に注ぎ、室温で45分間培養し、培地を捨てる。

注記：

すぐにコーティングしたペトリ皿は、-20 °C で使用または保存できますが、2 週間を超えて保存することはできません。

2. 新鮮な脱落膜組織を1倍PBSで3回洗浄して血栓と胎膜を除去し、絨毛組織を採取して眼科用ハサミで1mm×3片に切断した。

3. 0.25% トリプシンと 0.1% DNase I を加え、37 °C のウォーターバスで 5 分間穏やかに振盪しながら消化し、消化物を吸引して廃棄します。

4. 残った組織を0.25%トリプシンと0.1%DNaseIで37℃の水浴中で10分間消化し、消化物を吸引し、10%子牛血清を加えて消化を終了させます。これを3～4回繰り返し、上清をすべて回収します。

5. 栄養芽細胞を多く含む消化上清を80メッシュと300メッシュのふるいで順に濾過し、濾過液を回収し、300gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。6. The cell pellets were resuspended and plated on a discontinuous Percoll gradient (10%~70%, one gradient per 10%), and centrifuged at 1000 g for 20 min.

7. 40%密度層（p=1.048~1.062 g/ml）の細胞を栄養膜細胞として吸収し、洗浄後、10%ウシ胎児血清を含むDMEM高グルコース培地を加える。

8. 細胞密度を5x10/mlに調整し、IV型コラーゲン（またはFNまたはマトリゲル）をコーティングしたプレートに植え、10分間接着培養して、接着しやすい線維芽細胞を取り除きます。最初の培養培地を交換する前に、37℃、5％CO2インキュベーターで24時間培養します。

9. 24時間後、倒立位相差顕微鏡で細胞の増殖状態を観察した。EVCTは移動・凝集はできるが融合せず、増殖能力は弱い。

10. 得られた細胞の免疫組織化学的同定は、ビメンチン陰性、CK7陽性という特徴に基づいて行われた。

11. 抗HLA-G表面抗体で標識した後、FACSAriaIIはHLA-G +絨毛絨毛外栄養膜細胞を95％以上の純度で選別・精製した。

注

●絨毛組織は、実験室条件に応じて、1 mg/ml コラーゲナーゼ IV と 0.1 mg/ml DNase I で消化できます。

●EVCT は増殖能力が弱く、継代培養が多すぎると細胞の特定の生物学的特性が失われやすいため、培養細胞では継代培養数を減らすことが重要です。

●EVCT と VCT はどちらも CK7 を発現しますが、ビメンチンは発現しません。c-erbB-2 免疫組織化学によって EVCT (c-erbB-2 陽性) と VCT (c-erbB-2 陰性) を区別できます。