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初代細胞は組織から直接分離された細胞です。正常細胞の形態を維持するだけでなく、体内の重要な生物学的マーカーと機能も保持しています。細胞株と比較して、初代細胞が提供する実験データは実際の生理学的環境に近いため、生物医学研究において大きな価値があります。

初代細胞は、その生物学的特性が基本的に不変であるため、体の成長特性をより正確にシミュレートすることができ、プロテオミクス、ゲノミクス、細胞研究、遺伝子研究など、分子生物学、細胞生物学、基礎生物医学研究で広く使用されています。同時に、バイオ医薬品の分野でも理想的な細胞モデルであり、疾患メカニズムの研究、薬物スクリーニング、薬物代謝、毒性評価、癌治療薬の研究、治療法開発に広く使用されています。

細胞抽出および体外培養とは、組織または臓器から細胞を分離し、適切な条件下で培養するプロセスを指します。具体的な手順は、無菌条件下で対象組織を取得し、トリプシンやコラーゲナーゼなどの消化酵素を使用して組織を単一細胞懸濁液に分離し、遠心分離、濾過などによって細胞を分離し、最後に適切な培養環境で細胞を培養して成長と機能を維持することです。

以下では、低速冷却遠心分離機を使用した一次細胞分離の具体的な手順を紹介します。

実験手順（消化培養法）

組織の準備と洗浄

滅菌状態で対象組織を約1cm³取り、プレートまたはビーカーに入れ、適量のハンクス液で繰り返し洗浄して血液残留物と結合組織を除去します。

組織の細分化と前処理

鋭いハサミを使用して組織を約 0.5 mm × 1 mm の小片に細分化し、ハンクス液で再度すすぎ、組織片が落ち着いたら洗浄液を捨てます。

酵素消化

組織片を滅菌マグネティックスターラーを取り付けた円錐形ビーカーに移し、5～30 mLのトリプシンまたはコラーゲナーゼを加えます。

ゴム栓でしっかりと覆い、アルミホイルで密封し、マグネティックスターラーの上に置き、37°Cのインキュベーターに入れます。

スターラーを始動し、均一にかき混ぜます。顕微鏡を使用して、消化プロセス中の細胞の分散を観察します。

ほとんどの細胞が単一の状態に解離したら（約10～20分）、すぐに適量のハンクス溶液を加えて消化を終了します。

細胞濾過

まず、100 μm のステンレス メッシュで濾過して、未消化の組織や大きな細胞塊を取り除きます。

次に、20 μm のステンレス メッシュで濾過して、比較的純粋な単一細胞懸濁液を得ます。

低速遠心分離と細胞洗浄

ろ液を遠心管に移し、500×gで遠心分離しました（約5分）。

上清を捨て、細胞をハンクス溶液で2回洗浄して、残留消化酵素を除去しました。

細胞を血清を含む培地に再懸濁し、穏やかに振盪して細胞懸濁液を調製しました。

細胞カウントと接種

血球計数器を使用して細胞懸濁液の濃度をカウントし、決定します (通常、1×10⁵～3×10⁵ 細胞/mL)。

細胞を培養皿に均等に接種し、37°C、5% CO₂インキュベーターで培養します。

この方法により、生存率の高い初代細胞を効果的に取得し、その後の実験に信頼性の高い細胞モデルを提供できます。低速冷却遠心分離機を使用すると、細胞の生存率を確保しながら初代細胞の分離効率を向上させることができ、その後の実験に高品質の細胞サンプルを提供できます。

注記

組織の洗浄

消化前に、組織ブロックを 2 ～ 3 回洗浄して、トリプシンと EDTA に対するカルシウム、マグネシウムイオン、血清の阻害効果を除去する必要があります。

ハンクス溶液またはその他の適切な緩衝液を使用して、洗浄液中の組織ブロックを軽く振ったりかき混ぜたりすることができます。干渉物質が完全に除去されたら、洗浄液を廃棄して酵素消化の効果を確保できます。

消化酵素の役割

トリプシンは膵臓から分泌されるタンパク質分解酵素です。主にリジンとアルギニンを繋ぐペプチド結合に作用し、タンパク質をより小さなポリペプチドとアミノ酸に分解して、細胞の分散を助けます。

コラーゲナーゼは細菌由来で、コラーゲンを加水分解する強力な能力があります。繊維組織、上皮組織、さらには一部の癌組織を効果的に消化できます。

細胞生存率の向上

初代培養細胞の播種密度を適切に高めることで、細胞間の相互作用を促進し、細胞を生体内の成長環境に近づけることができ、細胞の生存率が向上し、接着と増殖が促進されます。

一次細胞分離実験における遠心分離機の重要な役割

一次細胞分離のプロセスでは、低速冷却遠心分離機が重要な役割を果たし、主に細胞の濃縮、消化酵素と残渣の除去、細胞生存率の向上に使用されます。実験における主な用途は次のとおりです。

細胞の濃縮と収集

消化後、組織は単一の細胞懸濁液に解離されますが、不完全に消化された組織断片、消化酵素残渣、細胞断片が混ざっている場合があります。低速冷却遠心分離機を適切に設定することで、無傷の細胞を効果的に沈殿させ、上清中の酵素と破片を除去し、比較的純粋な細胞懸濁液を得ることができます。

細胞を洗浄して残留消化酵素を除去します

トリプシンやコラーゲナーゼなどの消化酵素は、細胞の正常な機能に影響を与えたり、細胞に毒性を及ぼす可能性があります。そのため、最初の遠心分離後、細胞を無血清培地またはハンクス溶液に再懸濁し、2 回洗浄する必要があります。そのたびに低速で遠心分離し、上清を捨てて、残留酵素のほとんどを除去し、細胞の生存率を向上させる必要があります。

細胞濃縮と培養条件の最適化

接種前に、低速遠心分離により細胞をさらに濃縮し、接種密度を高めることができます。適切な細胞密度は、細胞間の相互作用を促進するだけでなく、接着と増殖を促進し、それによって初代細胞の生存率と培養の成功率を高めます。

低速冷却遠心分離機は、初代細胞の分離に重要な役割を果たすだけでなく、細胞培養、臨床医学、バイオ医薬品、分子生物学、血液処理などの多くの分野で広く使用されています。その低速性と効率的な温度制御機能により、温度に敏感なサンプル処理に最適です。遠心分離機を使用する場合、実験の成功率を向上させ、サンプルの完全性と実験結果の安定性を確保するために、遠心分離パラメータと操作手順を適切に最適化する必要があります。