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I macrofagi sono essenziali nel sistema immunitario del corpo, svolgono un ruolo importante nella fagocitosi dei patogeni, nella regolazione delle risposte immunitarie e nel mantenimento dell'omeostasi tissutale. Attraverso il metodo di estrazione primaria, i ricercatori possono evitare i cambiamenti genetici e il declino funzionale che possono essere causati da molteplici passaggi di linee cellulari e ottenere direttamente macrofagi con attività biologica completa da organismi viventi, il che costituisce una solida base per esperimenti successivi.

I macrofagi primari derivati dal midollo osseo sono solitamente rotondi o ovali quando non stimolati, con dimensioni cellulari variabili, nuclei piccoli, per lo più rotondi o ovali, cromatina lassa e nucleoli evidenti. Vacuoli e sostanze granulari sono comuni nel citoplasma e queste strutture sono strettamente correlate alla loro funzione fagocitaria.

Le centrifughe svolgono un ruolo fondamentale nel processo di estrazione delle cellule BMDM. Attraverso la fase di centrifugazione, possiamo separare e precipitare efficacemente le cellule per ottenere macrofagi del midollo osseo di alta qualità. Il processo di centrifugazione non solo aiuta a rimuovere le impurità, ma garantisce anche la purezza e l'attività delle cellule, che è un collegamento chiave indispensabile nel processo di estrazione.

Di seguito sono riportati i passaggi dettagliati e le precauzioni per il metodo di estrazione primaria dei macrofagi usando i topi come esempio:

Preparazione del materiale sperimentale

Animali sperimentali: topi C57BL/J

Reagenti: terreno di coltura DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente il 10% di FBS, il 75% di etanolo, PBS sterile.

Attrezzatura sperimentale: siringhe monouso, strumenti chirurgici, provette da centrifuga, centrifughe, piastre per coltura cellulare o fiasche per coltura, ecc.

Fasi sperimentali

●Anestesia e uccisione: dopo aver anestetizzato i topi, sono stati uccisi rapidamente e umanamente tramite dislocazione, seguendo l'etica degli esperimenti sugli animali e riducendo al minimo il dolore dei topi.

●Disinfezione superficiale: immergere i topi in un becher contenente etanolo al 75% per 5 minuti. Dopo un'accurata disinfezione, utilizzare un tovagliolo di carta pulito per assorbire l'alcol in eccesso.

●Trattamento della pelle e delle articolazioni: utilizzare forbici sterilizzate per tagliare una piccola incisione sul dorso del topo, strappare la pelle fino all'articolazione del polpaccio a mani nude e rimuovere l'articolazione del piede e la pelle.

●Campionamento delle zampe e disinfezione secondaria: utilizzare forbici sterilizzate per smontare con attenzione gli arti posteriori dal grande trocantere alla radice della coscia per evitare fratture. Dopo aver rimosso i muscoli, immergere le ossa delle zampe in una capsula di coltura con etanolo al 75% per 5 minuti. 

●Dopo 5 minuti, togliere le ossa delle zampe dalla capsula di coltura in etanolo, posizionarle in una nuova capsula di coltura in etanolo e spostarle sul banco pulito per creare un ambiente sterile per gli esperimenti successivi.

Estrazione e induzione delle cellule BMDM

● Pretrattamento delle ossa delle zampe: trasferire le ossa delle zampe di topo imbevute di etanolo in un contenitore riempito con PBS freddo, immergere completamente e risciacquare l'etanolo sulla superficie dell'osso con PBS, ripetere 3 volte per garantire una pulizia completa.

● Estrazione del midollo osseo: separare il femore e la tibia puliti e tagliare entrambe le estremità con forbici sterilizzate. Utilizzare una siringa da 1 ml per assorbire il mezzo di induzione freddo, mirare all'estremità dell'osso e soffiare fuori il midollo osseo, quindi soffiare e lavare ripetutamente per circa 3 volte fino a quando non ci sono residui evidenti di midollo osseo rosso nell'osso della gamba.

● Dispersione e filtrazione delle cellule: utilizzare una pipetta da 5 ml per soffiare delicatamente il mezzo contenente cellule del midollo osseo per disperdere i grumi cellulari. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere le impurità e trasferire il filtrato in una provetta da centrifuga da 15 ml. 

● Centrifugazione e risospensione: centrifugare a 1500 giri/min per 5 minuti e scartare il surnatante. Aggiungere tampone di lisi dei globuli rossi per risospendere le cellule, lasciare riposare per 5 minuti, quindi centrifugare alla stessa velocità per 5 minuti e scartare il surnatante. Infine, risospendere il pellet cellulare con mezzo di induzione freddo.

● Coltura cellulare e sostituzione del mezzo: piastrare le cellule come richiesto. Il terzo giorno, metà del mezzo di coltura è stata sostituita per mantenere un ambiente di coltura stabile; il quinto giorno, è stata sostituita una quantità completa di mezzo di coltura fresco per soddisfare le esigenze di crescita e differenziazione cellulare; il settimo giorno, le cellule hanno raggiunto uno stato utilizzabile.

Note

●Le cellule BMDM non possono essere sottoposte a passaggio: a causa delle speciali caratteristiche biologiche delle cellule BMDM, non sono adatte alle operazioni di passaggio.

●Evitare la digestione con tripsina: la tripsina viene spesso utilizzata per separare le cellule aderenti, ma non è adatta alle cellule BMDM. L'attività proteolitica della tripsina distruggerà la membrana cellulare e le proteine chiave, causando l'inattivazione delle cellule e rendendole inutilizzabili per gli esperimenti successivi. Pertanto, non utilizzare la tripsina per trattare le cellule BMDM.

●Si consiglia di utilizzare uno scraper cellulare: a causa delle limitazioni del passaggio e della digestione con tripsina, si consiglia di utilizzare uno scraper cellulare per raschiare delicatamente le cellule BMDM.

●Evitare frequenti cambi di contenitori di coltura: le cellule BMDM sono fragili e sensibili all'ambiente. Si consiglia di piastrarle direttamente per gli esperimenti dopo l'acquisizione. Frequenti cambi di contenitori di coltura possono causare disturbi fisici, causando collisioni e tirate cellulari, danneggiando così le cellule e interferendo con i risultati sperimentali.

Quanto sopra è il processo dettagliato di estrazione delle cellule BMDM che sarà utile per gli utenti. Negli esperimenti biologici, Welso può fornirti tutti gli strumenti sperimentali di cui hai bisogno. Vale la pena menzionare in particolare che la nostra serie di centrifughe è un assistente indispensabile nell'esperimento. Ci concentriamo sulla fornitura di prodotti per centrifughe di alta qualità a clienti globali, tra cui centrifughe a bassa velocità, centrifughe ad alta velocità, centrifughe refrigerate, mini centrifughe e centrifughe da pavimento di grande capacità. Se sei interessato ai nostri prodotti, ti preghiamo di contattarci in tempo e otterrai il miglior preventivo.