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Negli esperimenti di biologia molecolare e di biologia cellulare, l'estrazione ad alta purezza delle proteine nucleari è un passaggio fondamentale nello studio dei processi nucleari come la regolazione genica, l'attività dei fattori di trascrizione e la struttura della cromatina. A causa della differenza di distribuzione tra proteine nucleari e proteine citoplasmatiche, per garantire l'accuratezza dei dati sperimentali, è necessario un metodo di estrazione delle proteine nucleari con bassa contaminazione incrociata e facile da usare per ottenere campioni di proteine nucleari ad alta purezza. Inoltre, le proteine nucleari sono sensibili all'ambiente esterno e si dovrebbe prestare particolare attenzione alle condizioni operative durante il processo di estrazione, come il controllo della temperatura e l'uso di inibitori della proteasi, per mantenere l'attività proteica ed evitare la degradazione.

È particolarmente importante scegliere il metodo di estrazione delle proteine nucleari appropriato per diverse esigenze sperimentali. Ad esempio, per proteine altamente espresse nel nucleo come HIF1-α e TWIST, si consiglia di utilizzare un kit di estrazione delle proteine nucleari o un tampone di lisi delle proteine nucleari dedicato per l'estrazione. Questi metodi non solo ottimizzano le fasi operative, ma riducono anche efficacemente la contaminazione incrociata tra citoplasma e proteine nucleari, fornendo una base di campione affidabile per esperimenti successivi (come Western Blot, immunoprecipitazione, ecc.).

Ecco due metodi di estrazione delle proteine nucleari relativamente facili da usare:

Per le proteine con elevata espressione nel nucleo, come HIF1-α e TWIST, per l'estrazione si dovrebbe usare uno speciale kit di estrazione delle proteine nucleari o un tampone di lisi delle proteine nucleari.

Fasi di estrazione delle proteine nucleari (metodo di macinazione per omogeneizzazione)

Preparazione

Prima dell'esperimento di estrazione delle proteine nucleari, è necessario preparare in anticipo i reagenti e i tamponi pertinenti per garantire che il processo sperimentale proceda senza intoppi. Di seguito sono riportate la formula dettagliata e l'uso della soluzione colorante blu di tripano e del tampone:

Formula della soluzione colorante blu di tripano

Preparazione della soluzione madre: pesare una quantità appropriata di polvere di blu di tripano e scioglierla in 10 mL di acqua bidistillata per preparare una soluzione madre di blu di tripano al 4% (p/v).

Diluizione della soluzione di lavoro: utilizzare il tampone PBS per diluire la soluzione madre 10 volte per ottenere una soluzione di lavoro con concentrazione dello 0,4%.

Uso: mescolare la soluzione di lavoro blu di tripano allo 0,4% e la sospensione cellulare a un volume di 1:1 per il conteggio delle cellule o il rilevamento dell'attività cellulare. Formula del tampone A (tampone di lisi cellulare)

Ingredienti:

10 mM HEPES (pH 7,9, 4°C)

1,5 mM MgCl₂

10 mM KCl

0,5 mM DTT (ditiotreitolo)

Se è necessario impedire che la degradazione delle proteine plasmatiche influenzi le proteine nucleari, è possibile aggiungere 1 mM PMSF (fenilmetilsulfonil fluoruro)

Funzione:

Utilizzato per la lisi della membrana cellulare, il rilascio dei nuclei cellulari e per garantire l'integrità del nucleo cellulare. Formula del tampone B (tampone di estrazione delle proteine nucleari)

Ingredienti:

20 mM HEPES (pH 7,9)

25% (v/v) glicerolo

0,42 M NaCl

1,5 mM MgCl₂

0,2 mM EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)

0,5 mM PMSF

0,5 mM DTT

Funzione:

Rottura della membrana nucleare e rilascio delle proteine nucleari mantenendo la stabilità e l'attività delle proteine.

Fasi di estrazione delle proteine nucleari

Raccolta delle cellule

● Digerire le cellule dalla fiasca e raccoglierle in microprovette.

● Centrifugare a 300 g per 5 min a 4°C e smaltire il surnatante.

● Lavare la precipitazione cellulare 3 volte con tampone PBS per garantire la rimozione delle impurità residue.

Preparazione per la lisi cellulare

● Dopo la centrifugazione, smaltire il surnatante. Aggiungere 5 volte il volume di tampone A preraffreddato (ad esempio, aggiungere 100 μL di tampone A per ogni 20 μL di precipitazione cellulare), pipettare per mescolare e sospendere completamente le cellule.

● Mettere la sospensione cellulare su ghiaccio per 10 min, quindi centrifugare a 300 g per 5 min a 4°C. Rilascio del nucleo

● Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, aggiungere di nuovo 25 volte il volume di Buffer A preraffreddato e pipettare delicatamente per risospendere le cellule.

● Trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore Dounce per l'omogeneizzazione.

Monitoraggio dell'omogeneizzazione

● Durante il processo di omogeneizzazione, prendere una piccola quantità di sospensione cellulare e mescolarla con un volume uguale di colorante blu Trypan allo 0,4%.

● Osservare la rottura della membrana cellulare al microscopio:

● Se la maggior parte delle cellule è colorata di blu, significa che la membrana cellulare è stata rotta e interrompere l'omogeneizzazione.

● Se non è completamente rotta, continuare l'omogeneizzazione.

Separazione del nucleo cellulare e del citoplasma

● Quando la maggior parte delle cellule è rotta, trasferire la sospensione cellulare in una provetta Eppendorf e centrifugare a 25.000 g per 20 min a 4 °C. Risultati della centrifugazione:

●Il supernatante contiene componenti citoplasmatici.

●Il precipitato è il nucleo cellulare, che contiene proteine nucleari.

Estrazione delle proteine nucleari

●Raccogliere il precipitato dopo la centrifugazione, aggiungere 1 volume di Buffer B preraffreddato e soffiare delicatamente per risospendere il precipitato.

●Trasferire la sospensione in un omogeneizzatore per tessuti pulito e omogeneizzare 30 volte per garantire che la proteina nucleare venga completamente rilasciata.

Dissoluzione ed estrazione delle proteine

●Trasferire la sospensione omogeneizzata in una provetta Eppendorf e incubarla in uno shaker a bassa velocità su ghiaccio per 45 minuti per garantire che la proteina nucleare venga completamente disciolta.

●Centrifugare a 25.000 g per 30 minuti a 4 °C e raccogliere il supernatante, che è la proteina nucleare purificata.

Fasi di estrazione delle proteine nucleari (metodo del kit)

Preparazione

Preparazione del reagente

●Equilibrare il kit di estrazione delle proteine nucleari a temperatura ambiente.

●Aggiungere PMSF al reagente di estrazione delle proteine plasmatiche e al reagente di estrazione delle proteine nucleari fino a una concentrazione finale di 1 mM.

●Se il campione contiene cisteina, aggiungere DTT a entrambi i reagenti fino a una concentrazione finale di 0,5 mM.

Raccolta e lavaggio delle cellule

●Digerire le cellule dalla parete della beuta e raccoglierle in una provetta Eppendorf.

●Centrifugare a 300 g per 5 min a 4°C e scartare il surnatante.

●Lavare le cellule 1-2 volte con tampone PBS per rimuovere le impurità residue.

Lisi cellulare

● Centrifugare a 300 g per 10 min a 4 °C e scartare il surnatante.

● Aggiungere 5 volumi di reagente di estrazione delle proteine plasmatiche (ad esempio, aggiungere 100 μL per 20 μL di pellet cellulare) e mescolare delicatamente capovolgendo per garantire che le cellule siano sospese uniformemente. Fare attenzione a non agitare con il vortex per prevenire un'eccessiva rottura delle cellule.

Reazione di lisi

● Mettere la sospensione cellulare su ghiaccio per 20 min per lisare completamente le cellule.

Separazione delle proteine citoplasmatiche

● Centrifugare a 250 g per 20 min a 4 °C e scartare il surnatante.

● Aggiungere 2 volumi di reagente di estrazione delle proteine plasmatiche preraffreddato al pellet cellulare e mescolare delicatamente.

Rilascio nucleare

● Utilizzare una siringa con un ago da 0,14 mm per soffiare delicatamente 5 volte per lisare completamente il pellet cellulare. ● Centrifugare a 10.000 g per 30 min a 4°C, raccogliere il surnatante (proteina citoplasmatica) e scartare il pellet (proteina nucleare).

Estrazione della proteina nucleare

● Aggiungere 50-100 μL di reagente di estrazione della proteina nucleare al precipitato della proteina nucleare e soffiare delicatamente 5 volte con una siringa ad ago da 0,14 mm di diametro per assicurarsi che il precipitato sia completamente sospeso.

● Collocare la sospensione su un agitatore a bassa velocità su ghiaccio e incubare per 45 minuti per favorire la dissoluzione della proteina nucleare.

Separazione delle nucleoproteine

● Centrifugare a 16.000 g per 5 minuti a 4°C e raccogliere il surnatante, che è la proteina nucleare cellulare estratta.

Fasi di estrazione delle proteine nucleari tissutali

Preparazione del campione di tessuto

●Pesare il campione di tessuto da estrarre.

●Tagliare il tessuto in piccoli pezzi il più possibile per aumentare l'efficienza di omogeneizzazione.

Omogeneizzazione del tessuto

●Aggiungere 300-500 μL di PBS per ogni 50 mg di tessuto.

●Utilizzare un omogeneizzatore per omogeneizzare completamente in condizioni di bagno di ghiaccio per garantire che il tessuto sia completamente dissociato e formi una sospensione uniforme.

Centrifugazione e raccolta del precipitato

●Centrifugare a 500 g per 3 min a 4 °C e scartare il surnatante nella sospensione di tessuto.

●Raccogliere il precipitato, che contiene cellule e organelli.

Estrazione nucleare cellulare

●Aggiungere il precipitato raccolto a 200 μL di soluzione di estrazione delle proteine plasmatiche.

●Continuare a estrarre le proteine nucleari cellulari secondo le fasi di centrifugazione sopra indicate.

La selezione di un metodo adatto dovrebbe essere determinata in base agli obiettivi sperimentali, alle dimensioni del campione e all'attrezzatura sperimentale. Nelle applicazioni pratiche, i ricercatori possono selezionare in modo flessibile un metodo di estrazione delle proteine nucleari adatto in base alle proprie esigenze e alle caratteristiche specifiche del campione. Indipendentemente dal metodo scelto, garantire l'accuratezza dell'operazione e le condizioni di bassa temperatura è la chiave per ottenere proteine nucleari di alta qualità.

Spero che questo articolo possa fornire preziosi riferimenti per tutti, contribuire a ottimizzare il processo di estrazione delle proteine nucleari e migliorare l'affidabilità e la ripetibilità dell'esperimento.