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Nel campo delle neuroscienze, studiare le funzioni delle cellule endoteliali cerebrovascolari e microvascolari è fondamentale per comprendere i normali processi fisiologici del cervello e i meccanismi di sviluppo delle malattie. La tecnologia di estrazione primaria delle cellule endoteliali microvascolari del cervello è stata ampiamente utilizzata, principalmente ottenendo queste cellule da modelli animali, per esplorare in profondità la struttura, la funzione e le interazioni delle cellule endoteliali. Questa tecnologia fornisce un importante riferimento per studiare la patogenesi delle malattie correlate e sviluppare farmaci terapeutici mirati, e promuove il progresso scientifico nel campo delle malattie cerebrovascolari e delle malattie neurodegenerative.

Welso ha messo insieme con cura un protocollo sperimentale per la separazione e l'estrazione delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) utilizzando una centrifuga a bassa velocità. L'articolo mira a fornire al personale di laboratorio una guida tecnica concisa e di facile comprensione, presentando in dettaglio i passaggi chiave e le precauzioni dell'esperimento e aiutando i ricercatori scientifici a padroneggiare rapidamente i punti chiave dell'operazione. Ci auguriamo che attraverso questa condivisione, possiamo fornire una guida pratica e supporto per la ricerca in campi correlati e accelerare il progresso della ricerca cerebrovascolare e neuroscientifica.

Introduzione alle BMEC

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali primarie (BMEC) sono un tipo importante di cellule isolate, coltivate ed espanse dal tessuto cerebrale. Sono principalmente distribuite nelle pareti dei microvasi cerebrali e costituiscono il componente principale della barriera emato-encefalica. Le BMEC svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione dello scambio di sostanze attraverso la barriera emato-encefalica, mantenendo la stabilità dell'ambiente interno del cervello e difendendosi dall'invasione di sostanze nocive dal mondo esterno. Sono un importante modello cellulare per studiare la funzione cerebrovascolare e i meccanismi delle malattie.

Materiali sperimentali

Animali sperimentali: ratti SD (4-6 settimane di età, maschi)

Strumenti e materiali di consumo: grandi forbici chirurgiche, pinze, provette da centrifuga da 50 mL, piastre a 6 pozzetti

Reagenti e soluzioni: etanolo al 75%, soluzione salina, collagenasi, BSA al 25%, polilisina

Terreno di coltura: terreno di coltura basale DMEM/F12, terreno di coltura completo DMEM/F12

Strumenti da laboratorio

Banco ultra-pulito: per operazioni sterili

Centrifuga a bassa velocità: per la separazione cellulare

Incubatore a CO2: fornisce un ambiente adatto per la coltura cellulare

Procedure sperimentali

Manipolazione degli animali da esperimento

●Dopo aver anestetizzato i ratti, immergerli in etanolo al 75% per circa 1 minuto per la disinfezione della superficie.

Ottenimento del cervello

● Tagliare la pelle sulla testa, rimuovere rapidamente e completamente il cervello e posizionarlo nel terreno di coltura basale DMEM/F12 preraffreddato.

Tessuto per la pulizia

● In un banco pulito, rimuovere i coaguli di sangue esterni, le meningi e i vasi sanguigni esterni del cervello (operare in una capsula).

● Rimuovere la materia bianca (struttura libera) e conservare la materia grigia (parti cerebrali sinistra e destra a forma di conchiglia).

Lavaggio

●Lavare ripetutamente il tessuto cerebrale utilizzando un terreno di coltura preraffreddato a 4°C per rimuovere le impurità.

Taglio e lavorazione preliminare

●Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi di circa 1 mm³ e trasferirli in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL.

●Tritare ulteriormente il tessuto e pipettare delicatamente per disperdere i pezzi di tessuto.

Centrifugazione

● Centrifugare a 900 rpm per 4 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Aggiungere 5 mL di terreno DMEM/F12 privo di siero e mescolare accuratamente con una pipetta.

● Aggiungere 10 mL di terreno e 100 μL di collagenasi II e digerire a 37°C per 30-45 minuti.

Preparare la piastra a 6 pozzetti

●Allo stesso tempo, utilizzare 1 mL di polilisina per rivestire la piastra a 6 pozzetti e incubare a 37°C.

Trattamento post-digestione

●Dopo la digestione, aggiungere il mezzo per neutralizzare, centrifugare a 900 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.

●Aggiungere 15 mL di soluzione BSA al 25% e centrifugare a 2000 giri/min per 20 minuti a temperatura ambiente.

Estrarre le cellule bersaglio

● Dopo la centrifugazione, la stratificazione è visibile: il precipitato rosso scuro nello strato inferiore sono le cellule microvascolari cerebrali.

● Sciacquare delicatamente la poli-L-lisina nella piastra a 6 pozzetti con soluzione salina e ripetere il lavaggio due volte.

Risospensione e coltura delle cellule

● Rimuovere il sedimento dei microvasi cerebrali inferiori, aggiungere soluzione salina fisiologica e mescolare bene, quindi centrifugare a 900 giri al minuto per 5 minuti a temperatura ambiente.

● Risospendere le cellule con terreno completo DMEM/F12 fresco, trasferire su una piastra rivestita a 6 pozzetti e coltivare in un'incubatrice.

Attraverso questa procedura sperimentale, abbiamo estratto e separato con successo le cellule endoteliali microvascolari del cervello di ratto, fornendo una solida base sperimentale per ulteriori ricerche. Durante tutto il processo, la centrifuga a bassa velocità è uno strumento chiave che ci aiuta a separare in modo efficiente le cellule e purificare la popolazione di cellule bersaglio. Per garantire l'accuratezza e la sicurezza dell'esperimento, Welso ha compilato alcuni punti operativi della centrifuga a bassa velocità come riferimento per gli operatori.

Ispezione e posizionamento dell'attrezzatura

● Assicurarsi che la centrifuga sia posizionata stabilmente su un tavolo solido per evitare instabilità causata da vibrazioni o inclinazioni.

● Controllare l'attrezzatura prima dell'uso e concentrarsi sul controllo del rotore e delle guarnizioni per assicurarsi che non vi siano danni o allentamenti.

Protezione durante il funzionamento

● Indossare occhiali protettivi e guanti da laboratorio durante il funzionamento per evitare schizzi di liquido che potrebbero causare danni alla pelle e agli occhi.

Velocità e carico

● Prestare attenzione alla velocità massima e al carico massimo dell'attrezzatura e non superare l'intervallo di carico della centrifuga.

● Selezionare la velocità e il tempo di centrifugazione appropriati in base ai requisiti sperimentali. La velocità e il tempo devono essere regolati in base alla densità del campione, allo scopo di separazione e al volume per evitare di influenzare l'effetto di separazione a causa di impostazioni dei parametri non corrette.

Preparazione e caricamento del campione

● Prima che il campione entri nella centrifuga, assicurarsi che la provetta, il coperchio, il contenitore e l'adattatore siano accuratamente bilanciati sulla bilancia, la tolleranza del peso non è generalmente superiore a 1 g, il requisito di precisione non è superiore a 0,1 g e soddisfa i requisiti del manuale dell'attrezzatura.

● I materiali riempiti nella provetta devono avere una densità simile per evitare vibrazioni causate da una distribuzione non uniforme del carico.

● La capacità del campione non deve superare il limite di capacità massima della provetta o del rotore per evitare che l'attrezzatura sia sbilanciata o danneggiata.

● Il campione deve essere posizionato simmetricamente nel rotore per garantire che la forza centrifuga sia distribuita uniformemente.

Specifiche operative

●È vietato aprire o chiudere il coperchio quando la centrifuga è in funzione per evitare lesioni accidentali.

●Dopo la centrifugazione, assicurarsi che il rotore si fermi completamente prima di aprire il coperchio. Quando si estrae il campione, fare attenzione a evitare il contatto con la provetta del campione ad alta temperatura o con schizzi di liquido.

Pulizia e manutenzione

●Dopo l'uso, pulire l'attrezzatura e il rotore in tempo per mantenere l'attrezzatura pulita ed evitare contaminazione o corrosione.

●Controllare regolarmente lo stato operativo della centrifuga per garantire stabilità e affidabilità a lungo termine dell'attrezzatura.

●Seguendo le precauzioni di cui sopra, è possibile garantire la sicurezza delle operazioni sperimentali e prolungare la durata dell'attrezzatura.

Le centrifughe sono essenziali in molti esperimenti di separazione ed estrazione cellulare. Seguire rigorosamente le specifiche operative della centrifuga può non solo garantire la sicurezza dell'esperimento, ma anche estendere la durata utile dell'attrezzatura e garantire l'affidabilità dei risultati sperimentali. Welso è un fornitore professionale di centrifughe. Puoi saperne di più sulle caratteristiche dettagliate e sui parametri tecnici delle centrifughe a bassa velocità tramite la nostra pagina prodotto. Ti invitiamo inoltre a contattarci in qualsiasi momento per ottenere il preventivo più adatto.