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ELISA (saggio immunoenzimatico) è una tecnologia di immunoanalisi basata sul legame specifico di antigene e anticorpo. Il suo principio di base è quello di fissare l'antigene o l'anticorpo di una concentrazione specifica sulla superficie di una micropiastra di polistirene mediante adsorbimento fisico, quindi aggiungere il campione da testare e utilizzare il grado di sviluppo del colore prodotto dalla reazione tra l'etichetta enzimatica e il substrato per riflettere indirettamente la presenza o l'assenza o la quantità dell'antigene o dell'anticorpo testato.

Come tipo di tecnologia di immunomarcatura (compresa la tecnologia di immunofluorescenza, la tecnologia immunoradiometrica, la tecnologia immunoenzimatica e la tecnologia dell'oro immunocolloidale), la tecnologia ELISA è stata ampiamente utilizzata nella ricerca scientifica e negli esperimenti clinici grazie alle sue caratteristiche di rilevamento rapido, sensibile, qualitativo o quantitativo.

L'ELISA è uno dei metodi sperimentali più comunemente utilizzati nella ricerca in biologia molecolare, immunologia e biologia cellulare, ma nell'operazione effettiva, le persone spesso incontrano varie difficoltà sperimentali. Ad esempio, negli esperimenti ELISA, un alto blanking è uno dei problemi comuni, che non solo influisce sull'accuratezza dei risultati sperimentali, ma può anche interferire con l'affidabilità dei dati. Pertanto, è particolarmente importante comprendere a fondo le ragioni dell'alto blanking e adottare misure di ottimizzazione efficaci.

L'elevato blanking si riferisce a un aumento anomalo del valore di assorbanza del controllo negativo o del blank nell'esperimento ELISA. Normalmente, il valore di assorbanza del pozzetto negativo dovrebbe essere inferiore a 0,1. Un valore di fondo troppo elevato interferirà con i risultati sperimentali, ridurrà l'accuratezza e l'affidabilità dei dati e renderà impossibile valutare accuratamente il vero contenuto dell'antigene o dell'anticorpo nel campione.

Le cause più comuni includono:

● La piastra non è pulita

Soluzione:

▼Lavare accuratamente

Un tempo di lavaggio insufficiente causerà residui di anticorpi, con conseguente colorazione del controllo negativo.

Provare a prolungare il tempo di lavaggio, aumentare il numero di lavaggi e aggiungere una quantità appropriata di tensioattivo (come Tween-20, 0,05%) alla soluzione di lavaggio.

Quando si lava la piastra a ogni passaggio, assicurarsi che il lavaggio sia accurato e picchiettare accuratamente la piastra finché non vi è più alcun liquido residuo evidente nel pozzetto.

▼Evitare la contaminazione incrociata

Quando si elimina la soluzione di lavaggio o si incubano gli anticorpi, fare attenzione a evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti.

Le punte delle pipette devono essere utilizzate una sola volta il più possibile per prevenire la contaminazione causata dall'uso ripetuto.

La carta da filtro utilizzata per battere la piastra non deve essere riutilizzata per evitare la contaminazione secondaria.

● La concentrazione di anticorpi o reagenti è troppo alta

Motivo: la concentrazione di anticorpi, anticorpi secondari marcati con enzima o substrato cromogenico è troppo alta, con conseguente aumento della reazione non specifica e aumento del segnale di fondo.

Soluzione:

▼Ottimizzare la concentrazione di anticorpi: diluire l'anticorpo a una concentrazione di lavoro adatta per evitare sovradosaggio.

▼Controllare la concentrazione del reagente: regolare rigorosamente la concentrazione di anticorpi secondari marcati con enzima e substrato cromogenico per evitare una concentrazione eccessiva.

▼Eseguire un esperimento di diluizione a gradiente: diluire gradualmente attraverso esperimenti preliminari per determinare la concentrazione ottimale di ciascun reagente e ridurre l'interferenza di oscuramento.

● Blocco incompleto

Motivo: la soluzione di blocco (come BSA) potrebbe reagire in modo incrociato con l'anticorpo, determinando un aumento del segnale di fondo. Se la concentrazione della soluzione di blocco è troppo bassa o il tempo di blocco è troppo breve, il blocco potrebbe non essere completo, causando il legame non specifico dell'anticorpo alla piastra ELISA, aumentando così il valore di fondo.

Soluzione:

▼Utilizzare una soluzione di blocco adatta e regolare la concentrazione della soluzione di blocco.

▼Il tempo di blocco dovrebbe essere sufficiente, in genere 1-2 ore (temperatura ambiente) o durante la notte a 4 °C.

▼Assicurarsi di lavare i pozzetti della piastra dopo il blocco per rimuovere la soluzione di blocco in eccesso.

●La reazione del colore è troppo lunga

Motivo: A causa di un'ottimizzazione non corretta del sistema, la reazione del colore del campione è debole. Per compensare questa carenza, il tempo di reazione del colore viene esteso. Il lungo tempo di reazione del colore porta a un aumento delle reazioni non specifiche del substrato.

Soluzione:

▼Il sistema di rilevamento deve essere ottimizzato e le concentrazioni del rivestimento, dell'anticorpo di rilevamento e del substrato devono essere regolate per garantire reazioni sensibili e specifiche.

▼Ridurre il tempo di reazione del colore, generalmente non più di 15 minuti, per garantire l'accuratezza dei risultati sperimentali ed evitare interferenze di oscuramento.

● Contaminazione o degradazione dei reagenti

Motivo: la contaminazione può verificarsi durante la preparazione o la conservazione di reagenti e tamponi, con conseguente aumento del bianco.

Soluzione:

▼ Utilizzare reagenti appena preparati per evitare la contaminazione incrociata.

▼ Utilizzare soluzioni filtrate per garantire la purezza dei reagenti.

▼ Controllare le date di scadenza di anticorpi, substrati, soluzioni di lavaggio e tamponi per evitare di utilizzare reagenti deteriorati.

● Temperatura e fattori ambientali

Motivo: una temperatura o un'umidità troppo elevate porteranno a reazioni non specifiche potenziate, con conseguente aumento del blanking

Soluzione:

▼ Controllare l'incubatrice per assicurarsi che la temperatura di incubazione sia stabile a 37 °C e incubare secondo il tempo di reazione nelle istruzioni.

▼ Evitare di esporre i pozzetti della piastra a temperature elevate o a luce intensa per un lungo periodo.

Strumenti e attrezzature sono la base per il successo degli esperimenti ELISA. Le attrezzature correlate comunemente utilizzate includono pipette, lettori di micropiastre, lavatrici per piastre e incubatori. Tutte le attrezzature devono essere regolarmente ispezionate e calibrate per garantire accuratezza e precisione. Welso fornisce attrezzature di alta qualità necessarie per vari esperimenti ELISA. Non esitare a contattarci per maggiori informazioni.