Blog

Le cellule con funzione trofoblastica sono chiamate trofoblasti, che hanno origine dal trofoblasto esterno all'embrione e sono un collegamento chiave in una gravidanza normale. Dopo l'impianto dell'embrione, i trofoblasti si dividono, si multiplasmano e si differenziano per formare EVCT e citotrofoblasti villosi (VCT) con caratteristiche biologiche nettamente diverse.

Il principio di base dell'isolamento e della coltura dei trofoblasti extravillosi villosi umani è che l'EVCT ha la capacità di invadere, si aggrega nella parte profonda della decidua uterina formando isole ed è in stretto contatto con le cellule della decidua uterina, che è una parte importante del microambiente immunitario materno e fetale.

Il tessuto villoso è stato selezionato dalla decidua e filtrato mediante digestione enzimatica, quindi macinato e filtrato, quindi è stata effettuata una centrifugazione a gradiente di densità e lo strato di densità al 40% è stato assorbito in base alla densità delle cellule per ottenere cellule del trofoblasto, mentre l'EVCT è stato ulteriormente purificato mediante coltura a breve termine in tempi diversi.

In base alla morfologia, al fenotipo e alle caratteristiche funzionali delle cellule, queste sono state identificate, isolate e purificate mediante immunoistochimica o anticorpi fluorescenti che hanno simultaneamente marcato gli antigeni di superficie cellulare per l'ordinamento mediante citometria a flusso, il che costituisce la base per una discussione approfondita delle funzioni biologiche del trofoblasto.

Reagenti e strumenti

Reagente:

Soluzione PBS, soluzione D-Hanks, lisato RBC

Mezzo di coltura DMEM/F12, siero bovino fetale, tripsina

Collagenasi tipo IV, DNasi tipo I, fibronectina (FN)

Collagene tipo IV, Matrigel, soluzione madre Percoll, antibiotici

Strumento:

Forbici oftalmiche, pinzette, schermi di diverse dimensioni (80 mesh, 300 mesh)

Tutti i tipi di piastre di Petri, manici per siringhe, provette per centrifuga in plastica di diverse specifiche

Provette EP da 1,5 ml, pipette, centrifuga refrigerata a bassa velocità da tavolo Welso WLR600

Colonne di smistamento a poli magnetici e microsfere, incubatori a CO2, agitatori per bagnomaria, citofluorimetri

Procedura sperimentale

I passaggi di base per l'isolamento e la coltura dei trofoblasti extravillosi villosi umani possono essere suddivisi nei seguenti passaggi:

1. Preparazione del reagente

(1) Soluzione di collagene di tipo IV: sciogliere il collagene di tipo IV con acido acetico glaciale allo 0,25% e scioglierlo completamente a 4 °C durante la notte, con una concentrazione finale di 2,0 mg/ml. Durante l'uso, la piastra è stata confezionata a 6~10 μg/c㎡ e durante la notte a 4 °C. Le piastre di coltura cellulare rivestite con collagene di tipo IV possono essere sterilizzate durante la notte con irradiazione UV o risciacquate con etanolo al 75%.

(2) Soluzione FN: sciogliere 1 mg di polvere secca FN in 1 ml di acqua distillata sterile, lasciarla a temperatura ambiente per 30 minuti per scioglierla naturalmente e conservare a una concentrazione di 1 mg/ml. Aliquotare in 20 μl/provetta e conservare a -70 °C. (3) Sciogliere 20 μl di soluzione FN in 1 ml di terreno FD (concentrazione di 20 μg/ml), versare in una piastra Petri dal diametro di 35 mm, incubare a temperatura ambiente per 45 minuti e scartare il terreno.

Nota:

Le piastre Petri immediatamente rivestite possono essere utilizzate o conservate a -20 °C, ma non più di 2 settimane.

2. Il tessuto decidua fresco è stato lavato tre volte con PBS 1x per rimuovere i coaguli di sangue e le membrane fetali, e il tessuto villoso è stato ottenuto e tagliato in pezzi da 1 mm3 con forbici oftalmiche.

3. Aggiungere lo 0,25% di tripsina e lo 0,1% di DNasi I, digerire a bagnomaria a 37 °C agitando delicatamente per 5 minuti, quindi aspirare il digerito e scartarlo.

4. Il tessuto rimanente è stato digerito con tripsina allo 0,25% e DNasi I allo 0,1% in un bagno d'acqua a 37 °C per 10 minuti, la digestione è stata aspirata e si è aggiunto siero di vitello al 10% per terminare la digestione. Ripetere questa operazione per 3~4 volte e raccogliere tutto il surnatante.

5. Il surnatante digerito ricco di trofoblasti è stato filtrato a turno attraverso un setaccio da 80 maglie e uno da 300 maglie, il liquido filtrato è stato raccolto, centrifugato a 300 g per 10 minuti e il surnatante è stato scartato.

6. I pellet cellulari sono stati risospesi e piastrati su un gradiente Percoll discontinuo (10%~70%, un gradiente ogni 10%) e centrifugati a 1000 g per 20 min.

7. Assorbire le cellule con uno strato di densità del 40% (p=1,048~1,062 g/ml) come trofoblasti e aggiungere terreno di coltura DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente il 10% di siero bovino fetale dopo il lavaggio.

8. Regolare la densità cellulare a 5x10/ml, piantare in una piastra rivestita di collagene di tipo IV pre-rivestito (o FN o Matrigel) e incubare aderendo per 10 minuti per rimuovere facilmente i fibroblasti aderenti. Incubare in un incubatore a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore prima di cambiare il terreno di coltura per la prima volta.

9. Dopo 24 ore, lo stato di crescita delle cellule è stato osservato al microscopio a contrasto di fase invertito. L'EVCT può migrare e aggregarsi, ma non si fonde e la capacità proliferativa è debole.

10. L'identificazione immunoistochimica delle cellule ottenute è stata eseguita sulla base delle caratteristiche di vimentina negativa, CK7 positiva.

11. Dopo essere state etichettate con l'anticorpo di superficie anti-HLA-G, FACSAriaII ha selezionato e purificato le cellule trofoblastiche extravillose dei villi HLA-G+ con una purezza >95%.

Nota

●Il tessuto villoso può essere digerito con 1 mg/ml di collagenasi IV e 0,1 mg/ml di DNasi I a seconda delle condizioni di laboratorio.

●L'EVCT ha una debole capacità proliferativa e troppi passaggi possono facilmente causare la perdita di alcune caratteristiche biologiche delle cellule, quindi è importante ridurre il numero di passaggi nelle cellule coltivate.

●Sia l'EVCT che il VCT esprimono CK7 e non esprimono vimentina e possono essere identificati tramite immunoistochimica c-erbB-2 per distinguere tra EVCT (positivo per c-erbB-2) e VCT (negativo per c-erbB-2).