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Le cellule primarie sono cellule che vengono isolate direttamente dai tessuti. Non solo mantengono la morfologia delle cellule normali, ma mantengono anche i marcatori biologici chiave e le funzioni nel corpo. Rispetto alle linee cellulari, i dati sperimentali forniti dalle cellule primarie sono più vicini all'ambiente fisiologico reale, quindi sono di grande valore nella ricerca biomedica.

Poiché le loro proprietà biologiche sono sostanzialmente invariate, le cellule primarie possono simulare più accuratamente le caratteristiche di crescita del corpo e sono state ampiamente utilizzate nella biologia molecolare, nella biologia cellulare e nella ricerca biomedica di base, come la proteomica, la genomica, la ricerca cellulare e la ricerca genetica. Allo stesso tempo, sono anche modelli cellulari ideali nel campo dei biofarmaci e sono ampiamente utilizzate nella ricerca sui meccanismi delle malattie, nello screening dei farmaci, nel metabolismo dei farmaci, nella valutazione tossicologica, nella ricerca sui farmaci contro il cancro e nello sviluppo del trattamento.

L'estrazione cellulare e la coltura in vitro si riferiscono al processo di isolamento delle cellule da tessuti o organi e alla loro coltura in condizioni appropriate. I passaggi specifici includono: ottenere il tessuto target in condizioni sterili, utilizzare enzimi digestivi come tripsina o collagenasi per dissociare il tessuto in una sospensione di cellule singole, quindi separare le cellule tramite centrifugazione, filtrazione, ecc. e infine coltivarle in un ambiente di coltura adatto per mantenerne la crescita e la funzione.

Di seguito condivideremo i passaggi specifici per l'isolamento delle cellule primarie utilizzando una centrifuga refrigerata a bassa velocità:

Fasi sperimentali (metodo di coltura di digestione)

Preparazione e lavaggio dei tessuti

Prendere circa 1 cm³ di tessuto bersaglio in condizioni sterili, posizionarlo in una piastra o in un becher e risciacquarlo ripetutamente con una quantità adeguata di soluzione di Hanks per rimuovere residui di sangue e tessuto connettivo.

Triturazione e pretrattamento dei tessuti

Utilizzare forbici affilate per tritare il tessuto in piccoli pezzi di circa 0,5 mm × 1 mm, risciacquare nuovamente con la soluzione di Hanks e scartare la soluzione di lavaggio dopo che i pezzi di tessuto si sono depositati.

Digestione enzimatica

Trasferisci i pezzi di tessuto in un becher conico preinstallato con un agitatore magnetico sterile e aggiungi 5-30 mL di tripsina o collagenasi.

Copri ermeticamente con un tappo di gomma e sigilla con un foglio di stagno, quindi posiziona su un agitatore magnetico in un'incubatrice a 37 °C.

Accendi l'agitatore e mescola uniformemente. Utilizza un microscopio per osservare la dispersione cellulare durante il processo di digestione.

Quando la maggior parte delle cellule si è dissociata in un singolo stato (circa 10-20 minuti), aggiungi immediatamente una quantità appropriata di soluzione di Hanks per terminare la digestione.

Filtrazione cellulare

Per prima cosa, filtrare con una maglia di acciaio inossidabile da 100 μm per rimuovere il tessuto non digerito o i grandi cluster cellulari.

Quindi filtrare con una maglia di acciaio inossidabile da 20 μm per ottenere una sospensione di cellule singole relativamente pura.

Centrifugazione a bassa velocità e lavaggio delle cellule

Il filtrato è stato trasferito in una provetta da centrifuga e centrifugato a 500×g (circa 5 minuti).

Il surnatante è stato scartato e le cellule sono state lavate due volte con soluzione di Hanks per rimuovere gli enzimi digestivi residui.

Le cellule sono state risospese in un mezzo contenente siero e agitate delicatamente per preparare una sospensione cellulare.

Conteggio delle cellule e inoculazione

Utilizzare un emocitometro per contare e determinare la concentrazione della sospensione cellulare (solitamente 1×10⁵~3×10⁵ cellule/mL).

Inoculare uniformemente le cellule in una piastra di coltura e coltivare in un'incubatrice a 37°C, 5% di CO₂.

Questo metodo può ottenere efficacemente cellule primarie altamente vitali e fornire un modello cellulare affidabile per esperimenti successivi. L'uso di una centrifuga refrigerata a bassa velocità può aiutare a migliorare l'efficienza di separazione delle cellule primarie, garantendo al contempo la vitalità cellulare, fornendo campioni cellulari di alta qualità per esperimenti successivi.

Note

Risciacquo dei tessuti

Prima della digestione, i blocchi di tessuto devono essere risciacquati 2-3 volte per rimuovere gli effetti inibitori di calcio, ioni di magnesio e siero su tripsina ed EDTA.

La soluzione di Hanks o un altro tampone appropriato può essere utilizzata per agitare o mescolare delicatamente i blocchi di tessuto nella soluzione di risciacquo, e la soluzione di risciacquo può essere scartata dopo che le sostanze interferenti sono state completamente rimosse per garantire l'effetto della digestione enzimatica.

Il ruolo degli enzimi digestivi

La tripsina è un enzima proteolitico secreto dal pancreas. Agisce principalmente sui legami peptidici che collegano lisina e arginina, scomponendo le proteine in polipeptidi e amminoacidi più piccoli, il che aiuta le cellule a disperdersi.

La collagenasi deriva dai batteri e ha una forte capacità di idrolizzare il collagene. Può digerire efficacemente tessuto fibroso, tessuto epiteliale e persino alcuni tessuti cancerosi.

Migliorare il tasso di sopravvivenza cellulare

Aumentare adeguatamente la densità di semina delle cellule di coltura primaria può promuovere l'interazione tra le cellule e avvicinarle all'ambiente di crescita in vivo, migliorando così il tasso di sopravvivenza cellulare e promuovendo l'adesione e la proliferazione.

Il ruolo chiave della centrifuga negli esperimenti di separazione primaria delle cellule

Nel processo di separazione primaria delle cellule, la centrifuga refrigerata a bassa velocità svolge un ruolo fondamentale, utilizzata principalmente per l'arricchimento delle cellule, la rimozione di enzimi digestivi e detriti e il miglioramento del tasso di sopravvivenza delle cellule. Le sue principali applicazioni negli esperimenti includono:

Arricchimento e raccolta delle cellule

Dopo la digestione, il tessuto verrà dissociato in una sospensione cellulare singola, ma potrebbe essere mescolato con frammenti di tessuto non completamente digeriti, residui di enzimi digestivi e frammenti cellulari. Impostando correttamente la centrifuga refrigerata a bassa velocità, le cellule intatte possono essere efficacemente precipitate, gli enzimi e i detriti nel surnatante possono essere rimossi e si può ottenere una sospensione cellulare relativamente pura.

Lavare le cellule per rimuovere gli enzimi digestivi residui

Gli enzimi digestivi come tripsina e collagenasi possono influenzare la normale funzione delle cellule o addirittura essere tossici per le cellule. Pertanto, dopo la prima centrifugazione, le cellule devono essere risospese in un mezzo privo di siero o in una soluzione di Hanks e lavate due volte, ogni volta centrifugate a bassa velocità e il surnatante scartato per garantire che la maggior parte degli enzimi residui venga rimossa e che il tasso di sopravvivenza delle cellule venga migliorato.

Concentrazione cellulare e ottimizzazione delle condizioni di coltura

Prima dell'inoculazione, le cellule possono essere ulteriormente concentrate mediante centrifugazione a bassa velocità per aumentare la densità di inoculazione. Un'adeguata densità cellulare non solo facilita l'interazione cellula-cellula, ma promuove anche l'adesione e la proliferazione, aumentando così il tasso di sopravvivenza delle cellule primarie e il tasso di successo della coltura.

Le centrifughe refrigerate a bassa velocità non solo svolgono un ruolo chiave nella separazione delle cellule primarie, ma sono anche ampiamente utilizzate in molti campi come la coltura cellulare, la medicina clinica, la biofarmaceutica, la biologia molecolare e l'elaborazione del sangue. La sua bassa velocità e le sue efficienti capacità di controllo della temperatura la rendono una scelta ideale per l'elaborazione di campioni sensibili alla temperatura. Quando si utilizza una centrifuga, i parametri di centrifugazione e le procedure operative devono essere ragionevolmente ottimizzati per migliorare il tasso di successo dell'esperimento e garantire l'integrità del campione e la stabilità dei risultati sperimentali.