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Il lettore di micropiastre è uno strumento di laboratorio comune ampiamente utilizzato nella misurazione della concentrazione proteica e in altri esperimenti biochimici. Il suo principio si basa sul metodo dell'assorbanza della luce, che determina la concentrazione della sostanza target nel campione misurando l'assorbanza della luce della soluzione campione a una lunghezza d'onda specifica. Quando si utilizza un lettore di micropiastre, la proteina o altre sostanze biochimiche nel campione di solito reagiscono con uno specifico reagente colorato per generare un prodotto con specifiche caratteristiche di assorbimento della luce. Lo strumento emette luce di una specifica lunghezza d'onda e, dopo aver attraversato il campione, il rilevatore misura l'intensità della luce trasmessa.

Confrontando l'assorbanza con la curva standard, è possibile calcolare con precisione la concentrazione della sostanza target nel campione. La curva standard è solitamente composta da una serie di campioni standard di concentrazioni note e la sua assorbanza viene utilizzata per calibrare il lettore di micropiastre per garantire l'accuratezza dei risultati di misurazione. L'elevata sensibilità e l'elevata precisione del lettore di micropiastre lo rendono uno strumento essenziale per esperimenti biochimici come la misurazione della concentrazione proteica, l'analisi dell'attività enzimatica e gli esperimenti di proliferazione cellulare.

Le proteine sono importanti biomacromolecole negli organismi viventi e la determinazione del loro contenuto è di grande importanza nella ricerca in scienze biologiche e nell'industria biotecnologica. Il lettore di micropiastre è uno strumento di precisione utilizzato per rilevare la concentrazione di biomolecole, che analizza quantitativamente le molecole target in base al cambiamento di colore prodotto dalle reazioni catalizzate da enzimi.

Welso ha condiviso il metodo BCA (metodo colorimetrico) per determinare la concentrazione proteica. Il principio è che la proteina reagisce con ioni rame (Cu²⁺) in condizioni alcaline per formare un complesso viola-blu. Il complesso ha un picco di assorbimento caratteristico a una lunghezza d'onda specifica (solitamente 562 nm) e la sua assorbanza è linearmente proporzionale alla concentrazione proteica nel campione. Misurando l'assorbanza con un lettore enzimatico e confrontandola con la curva standard, la concentrazione proteica nel campione può essere calcolata con precisione. Questo metodo è ampiamente utilizzato per la rapida determinazione della concentrazione proteica grazie alla sua elevata sensibilità e al suo semplice funzionamento.

Scopo sperimentale 

Padroneggia l'uso di un lettore di micropiastre e familiarizza con il suo processo operativo e le sue funzioni.

Apprendi i principi di base e le fasi operative dell'analisi quantitativa delle proteine.

Misura la concentrazione proteica con il metodo BCA e verifica l'accuratezza dei risultati sperimentali.

Materiali e strumenti sperimentali 

Materiali

Soluzione proteica standard (ad esempio albumina di siero bovino)

Campione di soluzione proteica da testare

Soluzione BCA

Micropiastra a 96 pozzetti

Reagenti 

Solfato di rame

Solfato di sodio

Idrossido di sodio, ecc.

Strumenti 

Lettore ELISA

Bilancia elettronica

Pipettatori

Bagno termostatico

Fasi sperimentali 

●Impostazione delle curve standard

A. Preparare la soluzione BCA secondo le istruzioni del kit.

B. Diluire la soluzione standard proteica con acqua deionizzata a diversi gradienti di concentrazione (ad esempio 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ug/mL)

C. Aggiungere la soluzione standard diluita a ciascuna micropiastra da 96 pozzetti, 100 μL per pozzetto.

D. Aggiungere 100 μL di soluzione BCA a ciascun pozzetto e mescolare bene.

E. Collocare la micropiastra in un lettore ELISA e misurare il valore di assorbanza a una lunghezza d'onda di 562 nm

Impostare una curva standard con la concentrazione proteica come asse orizzontale e il valore di assorbanza come asse verticale

●Determinazione del campione

A. Diluire il campione di proteine da testare con acqua deionizzata a una concentrazione appropriata.

B. Aggiungere i campioni diluiti a una micropiastra a 96 pozzetti, 100 μL in ogni pozzetto.

C. Aggiungere 100 μL di soluzione BCA a ogni pozzetto e mescolare bene.

D. Collocare la micropiastra in un lettore ELISA e misurare il valore di assorbanza a una lunghezza d'onda di 562 nm.

●Analisi dei risultati

Sulla base del valore di assorbanza del campione misurato, trovare la proteina corrispondente sulla curva standard, quindi calcolare la concentrazione proteica della soluzione campione in base al volume del campione.

Il metodo BCA è un metodo di analisi quantitativa delle proteine comunemente utilizzato con i vantaggi di un funzionamento semplice, elevata sensibilità e forte specificità. Durante l'esperimento, si dovrebbe prestare particolare attenzione alla prevenzione della denaturazione, degradazione e contaminazione delle proteine per garantire l'accuratezza dei risultati. I risultati di questo esperimento mostrano che il metodo BCA può determinare efficacemente la concentrazione dei campioni di proteine e fornire un supporto dati affidabile per la successiva ricerca sulle proteine.

Questo esperimento ha utilizzato con successo lo strumento ELISA e il metodo BCA per determinare la concentrazione dei campioni proteici, ha verificato la fattibilità del metodo e ha fornito un importante riferimento per l'analisi quantitativa delle proteine.