Le blog

Dans les expériences de biologie moléculaire et de biologie cellulaire, l'extraction de protéines nucléaires de haute pureté est une étape clé dans l'étude des processus nucléaires tels que la régulation des gènes, l'activité des facteurs de transcription et la structure de la chromatine. En raison de la différence de distribution entre les protéines nucléaires et les protéines cytoplasmiques, afin de garantir l'exactitude des données expérimentales, une méthode d'extraction de protéines nucléaires avec une faible contamination croisée et une utilisation simple est nécessaire pour obtenir des échantillons de protéines nucléaires de haute pureté. De plus, les protéines nucléaires sont sensibles à l'environnement extérieur et une attention particulière doit être accordée aux conditions de fonctionnement pendant le processus d'extraction, telles que le contrôle de la température et l'utilisation d'inhibiteurs de protéase, pour maintenir l'activité des protéines et éviter leur dégradation.

Il est particulièrement important de choisir la méthode d'extraction de protéines nucléaires appropriée aux différents besoins expérimentaux. Par exemple, pour les protéines fortement exprimées dans le noyau telles que HIF1-α et TWIST, il est recommandé d'utiliser un kit d'extraction de protéines nucléaires ou un tampon de lyse de protéines nucléaires dédié pour l'extraction. Ces méthodes optimisent non seulement les étapes de l'opération, mais réduisent également efficacement la contamination croisée entre le cytoplasme et les protéines nucléaires, fournissant une base d'échantillon fiable pour les expériences ultérieures (telles que le Western Blot, l'immunoprécipitation, etc.).

Voici deux méthodes d'extraction de protéines nucléaires relativement faciles à utiliser :

Pour les protéines à forte expression dans le noyau, telles que HIF1-α et TWIST, un kit spécial d'extraction de protéines nucléaires ou un tampon de lyse de protéines nucléaires doit être utilisé pour l'extraction.

Étapes d'extraction de protéines nucléaires (méthode de broyage par homogénéisation)

Préparation

Avant l'expérience d'extraction de protéines nucléaires, les réactifs et tampons pertinents doivent être préparés à l'avance pour garantir le bon déroulement du processus expérimental. Voici la formule détaillée et l'utilisation de la solution de colorant bleu Trypan et du tampon :

Formule de la solution de colorant bleu Trypan

Préparation de la solution mère : Pesez une quantité appropriée de poudre de bleu Trypan et dissolvez-la dans 10 ml d'eau bidistillée pour préparer une solution mère de bleu Trypan à 4 % (p/v).

Dilution de la solution de travail : utilisez un tampon PBS pour diluer la solution mère 10 fois afin d'obtenir une solution de travail à 0,4 % de concentration.

Utilisation : Mélanger une solution de travail de bleu trypan à 0,4 % et une suspension cellulaire à un volume de 1:1 pour le comptage cellulaire ou la détection de l'activité cellulaire.

Formule du tampon A (tampon de lyse cellulaire)

Ingrédients :

10 mM HEPES (pH 7,9, 4°C)

1,5 mM MgCl₂

10 mM KCl

0,5 mM DTT (dithiothréitol)

Si vous devez empêcher la dégradation des protéines plasmatiques d'affecter les protéines nucléaires, vous pouvez ajouter 1 mM PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle)

Fonction :

Utilisé pour la lyse de la membrane cellulaire, la libération des noyaux cellulaires et pour assurer l'intégrité du noyau cellulaire.

Formule du tampon B (tampon d'extraction de protéines nucléaires)

Ingrédients :

20 mM HEPES (pH 7,9)

25 % (v/v) de glycérol

0,42 M NaCl

1,5 mM MgCl₂

0,2 mM EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique)

0,5 mM PMSF

0,5 mM DTT

Fonction :

Rupture de la membrane nucléaire et libération des protéines nucléaires tout en maintenant la stabilité et l'activité des protéines.

Étapes d'extraction des protéines nucléaires

Collecte des cellules

● Digérer les cellules du flacon et les collecter dans des microtubes.

● Centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4°C et éliminer le surnageant.

● Laver la précipitation cellulaire 3 fois avec un tampon PBS pour s'assurer que les impuretés résiduelles sont éliminées.

Préparation pour la lyse cellulaire

● Après centrifugation, éliminer le surnageant. Ajouter 5 fois le volume de tampon A pré-refroidi (par exemple, ajouter 100 μL de tampon A pour 20 μL de précipitation cellulaire), pipeter pour mélanger et suspendre complètement les cellules.

● Placer la suspension cellulaire sur de la glace pendant 10 min, puis centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4°C.

Libération du noyau

● Après centrifugation, jetez le surnageant, ajoutez à nouveau 25 fois le volume de tampon A pré-refroidi et pipettez doucement pour remettre les cellules en suspension.

● Transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur Dounce pour homogénéisation.

Suivi de l'homogénéisation

● Pendant le processus d'homogénéisation, prenez une petite quantité de suspension cellulaire et mélangez-la avec un volume égal de colorant bleu Trypan à 0,4 %.

● Observez la rupture de la membrane cellulaire au microscope :

● Si la plupart des cellules sont colorées en bleu, cela signifie que la membrane cellulaire a été rompue et arrêtez l'homogénéisation.

● Si elle n'est pas complètement rompue, continuez l'homogénéisation.

Séparation du noyau cellulaire et du cytoplasme

● Lorsque la plupart des cellules sont rompues, transférez la suspension cellulaire dans un tube Eppendorf et centrifugez à 25 000 g pendant 20 min à 4 °C.

Résultats de la centrifugation :

●Le surnageant contient des composants cytoplasmiques.

●Le précipité est le noyau cellulaire, qui contient la protéine nucléaire.

Extraction de protéines nucléaires

●Recueillez le précipité après centrifugation, ajoutez 1 volume de tampon B pré-refroidi et soufflez doucement pour remettre le précipité en suspension.

●Transférez la suspension dans un homogénéisateur de tissus propre et homogénéisez 30 fois pour vous assurer que la protéine nucléaire est entièrement libérée.

Dissolution et extraction des protéines

●Transférez la suspension homogénéisée dans un tube Eppendorf et incubez-la dans un agitateur à basse vitesse sur glace pendant 45 min pour vous assurer que la protéine nucléaire est entièrement dissoute.

●Centrifugez à 25 000 g pendant 30 min à 4 °C et récupérez le surnageant, qui est la protéine nucléaire purifiée.

Étapes d'extraction de protéines nucléaires (méthode du kit)

Préparation

Préparation des réactifs

●Équilibrer le kit d'extraction de protéines nucléaires à température ambiante.

●Ajouter du PMSF au réactif d'extraction de protéines plasmatiques et au réactif d'extraction de protéines nucléaires jusqu'à une concentration finale de 1 mM.

●Si l'échantillon contient de la cystéine, ajouter du DTT aux deux réactifs jusqu'à une concentration finale de 0,5 mM.

Collecte et lavage des cellules

●Digérer les cellules de la paroi du flacon et les collecter dans un tube Eppendorf.

●Centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4°C et jeter le surnageant.

●Laver les cellules 1 à 2 fois avec du tampon PBS pour éliminer les impuretés résiduelles.

Lyse cellulaire

●Centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4°C et jeter le surnageant.

● Ajoutez 5 volumes de réactif d'extraction de protéines plasmatiques (par exemple, ajoutez 100 μL pour 20 μL de culot cellulaire) et mélangez doucement en retournant pour garantir que les cellules sont uniformément suspendues. Veillez à éviter le vortexage pour éviter une perturbation excessive des cellules.

Réaction de lyse

● Placez la suspension cellulaire sur de la glace pendant 20 min pour lyser complètement les cellules.

Séparation des protéines cytoplasmiques

● Centrifugez à 250 g pendant 20 min à 4°C et jetez le surnageant.

● Ajoutez 2 volumes de réactif d'extraction de protéines plasmatiques pré-refroidi au culot cellulaire et mélangez doucement.

Libération nucléaire

● Utilisez une seringue avec une aiguille de 0,14 mm pour souffler doucement 5 fois pour lyser complètement le culot cellulaire.

● Centrifugez à 10 000 g pendant 30 min à 4°C, récupérez le surnageant (protéine cytoplasmique) et jetez le culot (protéine nucléaire).

Extraction de protéines nucléaires

●Ajoutez 50 à 100 μL de réactif d'extraction de protéines nucléaires au précipité de protéines nucléaires et soufflez doucement 5 fois avec une seringue à aiguille de 0,14 mm de diamètre pour vous assurer que le précipité est entièrement en suspension.

●Placez la suspension sur un agitateur à basse vitesse sur de la glace et incubez pendant 45 minutes pour favoriser la dissolution de la protéine nucléaire.

Séparation des nucléoprotéines

●Centrifugez à 16 000 g pendant 5 minutes à 4 °C et récupérez le surnageant, qui est la protéine nucléaire cellulaire extraite.

Étapes d'extraction de protéines nucléaires tissulaires

Préparation de l'échantillon de tissu

●Peser l'échantillon de tissu à extraire.

●Couper le tissu en petits morceaux autant que possible pour augmenter l'efficacité de l'homogénéisation.

Homogénéisation du tissu

●Ajouter 300 à 500 μL de PBS pour 50 mg de tissu.

●Utiliser un homogénéisateur pour homogénéiser complètement dans des conditions de bain de glace afin de garantir que le tissu est complètement dissocié et forme une suspension uniforme.

Centrifugation et collecte du précipité

●Centrifuger à 500 g pendant 3 min à 4 °C et éliminer le surnageant dans la suspension tissulaire.

●Recueillir le précipité, qui contient des cellules et des organites.

Extraction nucléaire cellulaire

●Ajouter le précipité collecté à 200 μL de solution d'extraction de protéines plasmatiques.

●Continuer à extraire les protéines nucléaires cellulaires selon les étapes de centrifugation ci-dessus.

Le choix d'une méthode appropriée doit être déterminé en fonction des objectifs expérimentaux, de la taille de l'échantillon et de l'équipement expérimental. Dans les applications pratiques, les chercheurs peuvent sélectionner de manière flexible une méthode d'extraction de protéines nucléaires appropriée en fonction de leurs propres besoins et des caractéristiques spécifiques de l'échantillon. Quelle que soit la méthode choisie, garantir la précision de l'opération et les conditions de basse température est la clé pour obtenir des protéines nucléaires de haute qualité.

J'espère que cet article pourra fournir des références précieuses à tout le monde, contribuer à optimiser le processus d'extraction des protéines nucléaires et améliorer la fiabilité et la répétabilité de l'expérience.