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Dans le domaine des neurosciences, l'étude des fonctions des cellules endothéliales cérébrovasculaires et microvasculaires est essentielle pour comprendre les processus physiologiques normaux du cerveau et les mécanismes de développement des maladies. La technologie d'extraction primaire des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales a été largement utilisée, principalement en obtenant ces cellules à partir de modèles animaux, pour explorer en profondeur la structure, la fonction et les interactions des cellules endothéliales. Cette technologie fournit une référence importante pour l'étude de la pathogénèse des maladies apparentées et le développement de médicaments thérapeutiques ciblés, et favorise le progrès scientifique dans le domaine des maladies cérébrovasculaires et des maladies neurodégénératives.

Welso a soigneusement élaboré un protocole expérimental pour la séparation et l'extraction de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) à l'aide d'une centrifugeuse à basse vitesse. L'article vise à fournir au personnel de laboratoire un guide technique concis et facile à comprendre, présentant en détail les étapes clés et les précautions de l'expérience, et aidant les chercheurs scientifiques à maîtriser rapidement les points clés de l'opération. Nous espérons que grâce à ce partage, nous pourrons fournir des conseils pratiques et un soutien à la recherche dans des domaines connexes et accélérer les progrès de la recherche cérébrovasculaire et des neurosciences.

Introduction aux BMEC

Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales primaires (BMEC) sont un type important de cellules isolées, cultivées et développées à partir du tissu cérébral. Elles sont principalement réparties dans les parois des microvaisseaux cérébraux et constituent le composant central de la barrière hémato-encéphalique. Les BMEC jouent un rôle essentiel dans la régulation de l'échange de substances à travers la barrière hémato-encéphalique, le maintien de la stabilité de l'environnement interne du cerveau et la défense contre l'invasion de substances nocives provenant du monde extérieur. Elles constituent un modèle cellulaire important pour l'étude de la fonction cérébrovasculaire et des mécanismes pathologiques.

Matériel expérimental

Animaux d'expérimentation : rats SD (âgés de 4 à 6 semaines, mâles)

Instruments et consommables : grands ciseaux chirurgicaux, pinces, tubes à centrifuger de 50 ml, plaques à 6 puits

Réactifs et solutions : éthanol à 75 %, solution saline, collagénase, BSA à 25 %, polylysine

Milieu de culture : milieu de culture basal DMEM/F12, milieu de culture complet DMEM/F12

Instruments de laboratoire

Paillasse ultra-propre : pour un fonctionnement stérile

Centrifugeuse à basse vitesse : pour la séparation des cellules

Incubateur à CO2 : offre un environnement adapté à la culture cellulaire

Procédures expérimentales

Manipulation des animaux de laboratoire

●Après avoir anesthésié les rats, les faire tremper dans de l'éthanol à 75 % pendant environ 1 minute pour désinfecter la surface.

Obtention du cerveau

●Coupez la peau de la tête, retirez rapidement et complètement le cerveau et placez-le dans un milieu de culture basal DMEM/F12 pré-refroidi.

Nettoyage des tissus

●Sur une paillasse propre, retirez les caillots sanguins externes, les méninges et les vaisseaux sanguins externes du cerveau (opérez dans une boîte de Pétri).

●Retirez la matière blanche (structure lâche) et conservez la matière grise (parties gauche et droite du cerveau en forme de coquille).

Lavage

●Lavez à plusieurs reprises le tissu cérébral en utilisant un milieu de culture pré-refroidi à 4 °C pour éliminer les impuretés.

Découpe et traitement préliminaire

●Coupez le tissu cérébral en petits morceaux d'environ 1 mm³ et transférez-le dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml.

●Hachez davantage le tissu et pipettez doucement pour disperser les morceaux de tissu.

Centrifugation

● Centrifuger à 900 tr/min pendant 4 minutes à température ambiante et éliminer le surnageant. Ajouter 5 ml de milieu DMEM/F12 sans sérum et bien mélanger à l'aide d'une pipette.

● Ajouter 10 ml de milieu et 100 μl de collagénase II et digérer à 37 °C pendant 30 à 45 minutes.

Préparez la plaque à 6 puits

●En même temps, utilisez 1 ml de polylysine pour recouvrir la plaque à 6 puits et incubez à 37 °C.

Traitement post-digestion

●Après digestion, ajouter du milieu pour neutraliser, centrifuger à 900 tr/min pendant 10 minutes à température ambiante et jeter le surnageant.

●Ajouter 15 ml de solution BSA à 25 % et centrifuger à 2 000 tr/min pendant 20 minutes à température ambiante.

Extraire les cellules cibles

● Après centrifugation, la stratification est visible : le précipité rouge foncé dans la couche inférieure correspond aux cellules microvasculaires cérébrales.

● Rincez délicatement la poly-L-lysine dans la plaque à 6 puits avec une solution saline et répétez le lavage deux fois.

Remise en suspension et culture des cellules

● Retirer le sédiment des microvaisseaux cérébraux inférieurs, ajouter du sérum physiologique et bien mélanger, puis centrifuger à 900 tr/min pendant 5 minutes à température ambiante.

● Remettre les cellules en suspension avec du milieu complet DMEM/F12 frais, transférer dans une plaque à 6 puits revêtue et cultiver dans un incubateur.

Grâce à cette procédure expérimentale, nous avons réussi à extraire et à séparer les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de rat, fournissant ainsi une base expérimentale solide pour des recherches ultérieures. Tout au long du processus, la centrifugeuse à basse vitesse est un outil essentiel qui nous aide à séparer efficacement les cellules et à purifier la population cellulaire cible. Afin de garantir l'exactitude et la sécurité de l'expérience, Welso a compilé certains points de fonctionnement de la centrifugeuse à basse vitesse pour référence par les opérateurs.

Inspection et mise en place de l'équipement

● Assurez-vous que la centrifugeuse est placée de manière stable sur une table solide pour éviter toute instabilité causée par des vibrations ou une inclinaison.

● Vérifiez l'équipement avant utilisation et concentrez-vous sur la vérification du rotor et des joints pour vous assurer qu'il n'y a aucun dommage ou desserrage.

Protection de fonctionnement

● Portez des lunettes de protection et des gants de laboratoire pendant le fonctionnement pour éviter les éclaboussures de liquide et les dommages à la peau et aux yeux.

Vitesse et charge

● Faites attention à la vitesse et à la charge maximales de l'équipement et ne dépassez pas la plage de charge de la centrifugeuse.

● Sélectionnez la vitesse et la durée de centrifugation appropriées en fonction des exigences expérimentales. La vitesse et la durée doivent être ajustées en fonction de la densité de l'échantillon, de l'objectif de séparation et du volume pour éviter d'affecter l'effet de séparation en raison de réglages de paramètres incorrects.

Préparation et chargement des échantillons

● Avant que l'échantillon n'entre dans la centrifugeuse, assurez-vous que le tube à centrifuger, le couvercle, le godet et l'adaptateur sont équilibrés avec précision sur la balance, que la tolérance de poids n'est généralement pas supérieure à 1 g, que l'exigence de précision n'est pas supérieure à 0,1 g et qu'elle répond aux exigences du manuel de l'équipement.

● Les matériaux remplis dans le tube à centrifuger doivent avoir une densité similaire pour éviter les vibrations causées par une répartition inégale de la charge.

● La capacité de l'échantillon ne doit pas dépasser la limite de capacité maximale du tube à centrifuger ou du rotor pour éviter que l'équipement ne soit déséquilibré ou endommagé.

●L'échantillon doit être placé symétriquement dans le rotor pour garantir une répartition uniforme de la force centrifuge.

Spécifications de fonctionnement

●Il est interdit d'ouvrir ou de fermer le couvercle lorsque la centrifugeuse est en marche pour éviter les blessures accidentelles.

●Après la centrifugation, assurez-vous que le rotor s'arrête complètement avant d'ouvrir le couvercle. Lors du prélèvement de l'échantillon, veillez à éviter tout contact avec le tube d'échantillon à haute température ou les éclaboussures de liquide.

Nettoyage et entretien

●Après utilisation, nettoyez l'équipement et le rotor à temps pour garder l'équipement propre et éviter la contamination ou la corrosion.

●Vérifiez régulièrement l'état de fonctionnement de la centrifugeuse pour assurer la stabilité et la fiabilité à long terme de l'équipement.

●En suivant les précautions ci-dessus, vous pouvez assurer la sécurité des opérations expérimentales et prolonger la durée de vie de l'équipement.

Les centrifugeuses sont essentielles dans de nombreuses expériences de séparation et d'extraction de cellules. Le respect strict des spécifications de fonctionnement de la centrifugeuse peut non seulement garantir la sécurité de l'expérience, mais également prolonger la durée de vie de l'équipement et garantir la fiabilité des résultats expérimentaux. Welso est un fournisseur professionnel de centrifugeuses. Vous pouvez en savoir plus sur les caractéristiques détaillées et les paramètres techniques des centrifugeuses à basse vitesse via notre page produit. Nous vous invitons également à nous contacter à tout moment pour obtenir le devis le plus adapté.