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L'ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) est une technologie d'immuno-analyse basée sur la liaison spécifique d'un antigène et d'un anticorps. Son principe de base consiste à fixer un antigène ou un anticorps d'une concentration spécifique sur la surface d'une microplaque en polystyrène par adsorption physique, puis à ajouter l'échantillon à tester et à utiliser le degré de développement de couleur produit par la réaction entre le marqueur enzymatique et le substrat pour refléter indirectement la présence ou l'absence ou la quantité de l'antigène ou de l'anticorps testé.

En tant que type de technologie d'immunoétiquetage (comprenant la technologie d'immunofluorescence, la technologie immunoradiométrique, la technologie d'immunoenzyme et la technologie de l'or immunocolloïdal), la technologie ELISA a été largement utilisée dans la recherche scientifique et les expériences cliniques en raison de ses caractéristiques de détection rapide, sensible, qualitative ou quantitative.

L'ELISA est l'une des méthodes expérimentales les plus couramment utilisées dans la recherche en biologie moléculaire, en immunologie et en biologie cellulaire, mais dans la pratique, les gens rencontrent souvent diverses difficultés expérimentales. Par exemple, dans les expériences ELISA, un blanking élevé est l'un des problèmes courants, qui affecte non seulement la précision des résultats expérimentaux, mais peut également interférer avec la fiabilité des données. Par conséquent, il est particulièrement important de comprendre en profondeur les raisons d'un blanking élevé et de prendre des mesures d'optimisation efficaces.

Un blanking élevé fait référence à une augmentation anormale de la valeur d'absorption du contrôle négatif ou du blanc dans l'expérience ELISA. Normalement, la valeur d'absorption du puits négatif doit être inférieure à 0,1. Une valeur de fond trop élevée interférera avec les résultats expérimentaux, réduira la précision et la fiabilité des données et rendra impossible l'évaluation précise du contenu réel de l'antigène ou de l'anticorps dans l'échantillon.

Les causes courantes incluent :

● L'assiette n'est pas propre

Solution :

▼Laver soigneusement

Un temps de lavage insuffisant entraînera la formation de résidus d'anticorps, ce qui entraînera une coloration du contrôle négatif.

Essayez de prolonger le temps de lavage, d'augmenter le nombre de lavages et d'ajouter une quantité appropriée de tensioactif (par exemple Tween-20, 0,05 %) à la solution de lavage.

Lors du lavage de la plaque à chaque étape, assurez-vous que le lavage est minutieux et tapotez soigneusement la plaque jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de liquide résiduel évident dans le puits.

▼Éviter la contamination croisée

Lors de l'élimination de la solution de lavage ou de l'incubation des anticorps, veillez à éviter la contamination croisée entre les puits.

Les embouts de pipette doivent être utilisés une fois autant que possible pour éviter la contamination causée par une utilisation répétée.

Le papier filtre utilisé lors du tapotement de la plaque ne doit pas être réutilisé pour éviter une contamination secondaire.

● La concentration d'anticorps ou de réactif est trop élevée

Raison : La concentration d'anticorps, d'anticorps secondaire marqué par une enzyme ou de substrat chromogène est trop élevée, ce qui entraîne une augmentation de la réaction non spécifique et du signal de fond.

Solution :

▼Optimiser la concentration d'anticorps : diluer l'anticorps à une concentration de travail appropriée pour éviter un surdosage.

▼Contrôler la concentration du réactif : ajuster strictement la concentration d'anticorps secondaire marqué par une enzyme et de substrat chromogène pour éviter une concentration excessive.

▼Effectuer une expérience de dilution en gradient : diluer progressivement au cours d'expériences préliminaires pour déterminer la concentration optimale de chaque réactif et réduire l'interférence de masquage.

● Blocage incomplet

Raison : La solution de blocage (comme la BSA) peut réagir de manière croisée avec l'anticorps, ce qui entraîne une augmentation du signal de fond. Si la concentration de la solution de blocage est trop faible ou si le temps de blocage est trop court, le blocage peut ne pas être complet, ce qui entraîne une liaison non spécifique de l'anticorps à la plaque ELISA, augmentant ainsi la valeur de fond.

Solution :

▼Utilisez une solution de blocage adaptée et ajustez la concentration de la solution de blocage.

▼Le temps de blocage doit être suffisant, généralement 1 à 2 heures (température ambiante) ou toute la nuit à 4 °C.

▼Assurez-vous de laver les puits de la plaque après le blocage pour éliminer l'excès de solution de blocage.

●La réaction colorée est trop longue

Raison : En raison d'une optimisation incorrecte du système, la réaction colorée de l'échantillon est faible. Afin de compenser cette déficience, le temps de réaction colorée est prolongé. Le long temps de réaction colorée entraîne une augmentation des réactions non spécifiques du substrat.

Solution :

▼Le système de détection doit être optimisé et les concentrations du revêtement, de l'anticorps de détection et du substrat doivent être ajustées pour garantir des réactions sensibles et spécifiques.

▼Réduisez le temps de réaction de la couleur, généralement pas plus de 15 minutes, pour garantir l'exactitude des résultats expérimentaux et éviter les interférences de masquage.

● Contamination ou dégradation des réactifs

Raison : une contamination peut se produire pendant la préparation ou le stockage des réactifs et des tampons, entraînant une augmentation du masquage.

Solution :

▼Utilisez des réactifs fraîchement préparés pour éviter la contamination croisée.

▼Utilisez des solutions filtrées pour garantir la pureté des réactifs.

▼Vérifiez les dates d'expiration des anticorps, des substrats, des solutions de lavage et des tampons pour éviter d'utiliser des réactifs détériorés.

● Température et facteurs environnementaux

Raison : Une température ou une humidité trop élevée entraînera des réactions non spécifiques renforcées, ce qui entraînera une augmentation du blanchiment

Solution :

▼ Vérifiez l'incubateur pour vous assurer que la température d'incubation est stable à 37 °C et incubez conformément au temps de réaction indiqué dans les instructions.

▼ Évitez d'exposer les puits de la plaque à des températures élevées ou à une forte lumière pendant une longue période.

Les instruments et équipements sont la base du succès des expériences ELISA. Les équipements associés couramment utilisés comprennent les pipettes, les lecteurs de microplaques, les laveurs de plaques et les incubateurs. Tous les équipements doivent être régulièrement inspectés et étalonnés pour garantir leur exactitude et leur précision. Welso fournit des équipements de haute qualité nécessaires à diverses expériences ELISA. N'hésitez pas à nous contacter pour plus d'informations.