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Les cellules à fonction trophoblastique sont appelées trophoblastes. Elles proviennent du trophoblaste extérieur à l'embryon et constituent un maillon essentiel d'une grossesse normale. Après l'implantation de l'embryon, les trophoblastes se divisent, se multiplient et se différencient pour former des EVCT et des cytotrophoblastes villeux (VCT) aux caractéristiques biologiques nettement différentes.

Le principe de base de l'isolement et de la culture des trophoblastes extravilleux villeux humains est que l'EVCT a la capacité d'envahir, de s'agréger dans la partie profonde de la décidue utérine pour former des îlots et d'être en contact étroit avec les cellules de la décidue utérine, qui constituent une partie importante du microenvironnement immunitaire maternel et fœtal.

Le tissu villeux a été sélectionné à partir de la caduque et filtré par digestion enzymatique, puis broyage et filtrage, et une centrifugation en gradient de densité a été effectuée, et la couche de densité de 40 % a été absorbée en fonction de la densité des cellules pour obtenir des cellules trophoblastiques, et l'EVCT a été davantage purifié par culture à court terme à différents moments.

Selon la morphologie, le phénotype et les caractéristiques fonctionnelles des cellules, celles-ci ont été identifiées, isolées et purifiées par immunohistochimie ou par des anticorps fluorescents qui ont simultanément marqué les antigènes de surface cellulaire pour le tri par cytométrie de flux, ce qui constitue une base pour une discussion approfondie des fonctions biologiques des trophoblastes.

Réactifs et instruments

Réactif:

Solution PBS, solution D-Hanks, lysat de globules rouges

Milieu de culture DMEM/F12, sérum de veau fœtal, trypsine

Collagénase de type IV, DNase de type I, fibronectine (FN)

Collagène de type IV, Matrigel, solution mère de Percoll, antibiotiques

Instrument:

Ciseaux ophtalmiques, pinces, tamis de différentes tailles (80 mesh, 300 mesh)

Tout type de boîtes de Petri, poignées de seringues, tubes à centrifuger en plastique de différentes spécifications

Tubes EP de 1,5 ml, pipettes, centrifugeuse réfrigérée à basse vitesse de table Welso WLR600

Colonnes de tri à pôles magnétiques et à billes, incubateurs à CO2, agitateurs à bain-marie, cytomètres de flux

Procédure expérimentale

Les étapes de base pour l'isolement et la culture des trophoblastes extravilleux villeux humains peuvent être divisées en étapes suivantes :

1. Préparation des réactifs

(1) Solution de collagène de type IV : dissoudre le collagène de type IV avec 0,25 % d'acide acétique glacial et le dissoudre complètement à 4 °C pendant la nuit, avec une concentration finale de 2,0 mg/ml. Lors de l'utilisation, la plaque a été emballée à 6~10 μg/c㎡ et pendant la nuit à 4 °C. Les plaques de culture cellulaire recouvertes de collagène de type IV peuvent être stérilisées pendant la nuit par irradiation UV ou rincées avec de l'éthanol à 75 %.

(2) Solution de FN : dissoudre 1 mg de poudre sèche de FN dans 1 ml d'eau distillée stérile, laisser à température ambiante pendant 30 minutes pour la dissoudre naturellement et conserver à une concentration de 1 mg/ml. Aliquoter dans 20 µl/tube et conserver à -70 °C.

(3) Dissoudre 20 μl de solution FN dans 1 ml de milieu FD (concentration de 20 μg/ml), verser dans une boîte de Petri d'un diamètre de 35 mm, incuber à température ambiante pendant 45 minutes et jeter le milieu.

Note:

Les boîtes de Petri immédiatement revêtues peuvent être utilisées ou conservées à -20 °C, mais pas plus de 2 semaines.

2. Le tissu décidual frais a été lavé trois fois avec du PBS 1x pour éliminer les caillots sanguins et les membranes fœtales, et le tissu villeux a été obtenu et coupé en morceaux de 1 mm 3 avec des ciseaux ophtalmiques.

3. Ajouter 0,25 % de trypsine et 0,1 % de DNase I, digérer au bain-marie à 37 °C en agitant doucement pendant 5 minutes, puis aspirer le produit de digestion et le jeter.

4. Le tissu restant a été digéré avec 0,25 % de trypsine et 0,1 % de DNase I dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 minutes, la digestion a été aspirée et 10 % de sérum de veau ont été ajoutés pour terminer la digestion. Répétez cette opération 3 à 4 fois et récupérez tout le surnageant.

5. Le surnageant digéré riche en trophoblastes a été filtré à travers un tamis de 80 mesh et de 300 mesh, le liquide filtré a été recueilli, centrifugé à 300 g pendant 10 minutes et le surnageant a été jeté.

6. Les culots cellulaires ont été remis en suspension et plaqués sur un gradient de Percoll discontinu (10 % à 70 %, un gradient pour 10 %), puis centrifugés à 1 000 g pendant 20 min.

7. Absorber les cellules avec une couche de densité de 40 % (p = 1,048 ~ 1,062 g/ml) sous forme de trophoblastes et ajouter du milieu de culture DMEM à haute teneur en glucose contenant 10 % de sérum bovin fœtal après lavage.

8. Ajuster la densité cellulaire à 5 x 10/ml, placer dans une plaque pré-enduite de collagène de type IV (ou FN ou Matrigel) et incuber de manière adhérente pendant 10 minutes pour éliminer facilement les fibroblastes adhérents. Incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 heures avant de changer le milieu de culture pour la première fois.

9. Après 24 h, l'état de croissance des cellules a été observé au microscope à contraste de phase inversé. L'EVCT peut migrer et s'agréger, mais il ne fusionne pas et sa capacité proliférative est faible.

10. L'identification immunohistochimique des cellules obtenues a été réalisée sur la base des caractéristiques de vimentine négative et de CK7 positive.

11. Après avoir été marqués avec un anticorps de surface anti-HLA-G, FACSAriaII a trié et purifié les cellules trophoblastiques extravilleuses des villosités HLA-G+ avec une pureté de > 95 %.

Note

●Le tissu villeux peut être digéré avec 1 mg/ml de collagénase IV et 0,1 mg/ml de DNase I selon les conditions de laboratoire.

●L'EVCT a une faible capacité proliférative et trop de passages peuvent facilement entraîner la perte de certaines caractéristiques biologiques des cellules, il est donc important de réduire le nombre de passages dans les cellules en culture.

●EVCT et VCT expriment tous deux CK7 et n'expriment pas la vimentine, et peuvent être identifiés par immunohistochimie c-erbB-2 pour distinguer EVCT (positif pour c-erbB-2) et VCT (négatif pour c-erbB-2).