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Les cellules primaires sont des cellules directement isolées des tissus. Elles conservent non seulement la morphologie des cellules normales, mais aussi les marqueurs biologiques et les fonctions clés de l'organisme. Par rapport aux lignées cellulaires, les données expérimentales fournies par les cellules primaires sont plus proches de l'environnement physiologique réel, elles sont donc d'une grande valeur pour la recherche biomédicale.

Les cellules primaires, qui ne présentent pas de modifications de leurs propriétés biologiques, peuvent simuler plus précisément les caractéristiques de croissance de l'organisme et sont largement utilisées en biologie moléculaire, en biologie cellulaire et en recherche biomédicale fondamentale, comme la protéomique, la génomique, la recherche cellulaire et la recherche génétique. Elles constituent également des modèles cellulaires idéaux dans le domaine biopharmaceutique et sont largement utilisées dans la recherche sur les mécanismes des maladies, le criblage de médicaments, le métabolisme des médicaments, l'évaluation toxicologique, la recherche sur les médicaments contre le cancer et le développement de traitements.

L'extraction cellulaire et la culture in vitro désignent le processus d'isolement des cellules à partir de tissus ou d'organes et leur culture dans des conditions appropriées. Les étapes spécifiques comprennent : l'obtention du tissu cible dans des conditions stériles, l'utilisation d'enzymes digestives telles que la trypsine ou la collagénase pour dissocier le tissu en une suspension cellulaire unique, puis la séparation des cellules par centrifugation, filtration, etc., et enfin leur culture dans un environnement de culture approprié pour maintenir leur croissance et leur fonction.

Ci-dessous, nous partagerons les étapes spécifiques de l’isolement cellulaire primaire à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée à basse vitesse :

Étapes expérimentales (méthode de culture par digestion)

Préparation et lavage des tissus

Prenez environ 1 cm³ de tissu cible dans des conditions stériles, placez-le dans une plaque ou un bécher et rincez-le à plusieurs reprises avec une quantité appropriée de solution de Hanks pour éliminer les résidus de sang et le tissu conjonctif.

Hachage et prétraitement des tissus

Utilisez des ciseaux pointus pour hacher le tissu en petits morceaux d'environ 0,5 mm × 1 mm, rincez à nouveau avec la solution de Hanks et jetez la solution de lavage une fois les morceaux de tissu déposés.

Digestion enzymatique

Transférez les morceaux de tissu dans un bécher conique préinstallé avec un agitateur magnétique stérile et ajoutez 5 à 30 ml de trypsine ou de collagénase.

Couvrez hermétiquement avec un bouchon en caoutchouc et scellez avec du papier d'aluminium, puis placez sur un agitateur magnétique dans un incubateur à 37 °C.

Démarrez l'agitateur et remuez uniformément. Utilisez un microscope pour observer la dispersion cellulaire pendant le processus de digestion.

Lorsque la plupart des cellules sont dissociées en un seul état (environ 10 à 20 minutes), ajoutez immédiatement une quantité appropriée de solution de Hanks pour terminer la digestion.

Filtration cellulaire

Tout d'abord, filtrez avec une maille en acier inoxydable de 100 μm pour éliminer les tissus non digérés ou les gros amas de cellules.

Ensuite, filtrez avec une maille en acier inoxydable de 20 μm pour obtenir une suspension de cellules individuelles relativement pure.

Centrifugation à basse vitesse et lavage des cellules

Le filtrat a été transféré dans un tube à centrifuger et centrifugé à 500 ×g (environ 5 minutes).

Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été lavées deux fois avec une solution de Hanks pour éliminer les enzymes digestives résiduelles.

Les cellules ont été remises en suspension dans un milieu contenant du sérum et agitées doucement pour préparer une suspension cellulaire.

Comptage et inoculation des cellules

Utilisez un hémocytomètre pour compter et déterminer la concentration de la suspension cellulaire (généralement 1×10⁵~3×10⁵ cellules/mL).

Inoculer uniformément les cellules dans une boîte de culture et les cultiver dans un incubateur à 37°C, 5% CO₂.

Cette méthode permet d'obtenir efficacement des cellules primaires hautement viables et de fournir un modèle cellulaire fiable pour les expériences ultérieures. L'utilisation d'une centrifugeuse réfrigérée à basse vitesse peut aider à améliorer l'efficacité de séparation des cellules primaires tout en garantissant la viabilité cellulaire, en fournissant des échantillons de cellules de haute qualité pour les expériences ultérieures.

Remarques

Rinçage des tissus

Avant la digestion, les blocs de tissus doivent être rincés 2 à 3 fois pour éliminer les effets inhibiteurs des ions calcium, magnésium et sérum sur la trypsine et l'EDTA.

La solution de Hanks ou un autre tampon approprié peut être utilisé pour agiter ou remuer doucement les blocs de tissus dans la solution de rinçage, et la solution de rinçage peut être jetée une fois les substances interférentes complètement éliminées pour garantir l'effet de la digestion enzymatique.

Le rôle des enzymes digestives

La trypsine est une enzyme protéolytique sécrétée par le pancréas. Elle agit principalement sur les liaisons peptidiques reliant la lysine et l'arginine, décomposant les protéines en polypeptides et acides aminés plus petits, ce qui aide les cellules à se disperser.

La collagénase est dérivée des bactéries et possède une forte capacité à hydrolyser le collagène. Elle peut digérer efficacement les tissus fibreux, les tissus épithéliaux et même certains tissus cancéreux.

Améliorer le taux de survie cellulaire

L'augmentation appropriée de la densité d'ensemencement des cellules de culture primaire peut favoriser l'interaction entre les cellules et les rapprocher de l'environnement de croissance in vivo, améliorant ainsi le taux de survie cellulaire et favorisant l'adhésion et la prolifération.

Le rôle clé de la centrifugeuse dans les expériences de séparation des cellules primaires

Dans le processus de séparation des cellules primaires, la centrifugeuse réfrigérée à basse vitesse joue un rôle essentiel, principalement utilisé pour l'enrichissement des cellules, l'élimination des enzymes digestives et des débris et l'amélioration du taux de survie des cellules. Ses principales applications dans les expériences comprennent :

Enrichissement et collecte des cellules

Après digestion, le tissu sera dissocié en une suspension cellulaire unique, mais il peut être mélangé à des fragments de tissu incomplètement digérés, à des résidus d'enzymes digestives et à des fragments de cellules. En réglant correctement la centrifugeuse réfrigérée à basse vitesse, les cellules intactes peuvent être efficacement précipitées, les enzymes et les débris du surnageant peuvent être éliminés et une suspension cellulaire relativement pure peut être obtenue.

Laver les cellules pour éliminer les enzymes digestives résiduelles

Les enzymes digestives telles que la trypsine et la collagénase peuvent affecter le fonctionnement normal des cellules ou même être toxiques pour les cellules. Par conséquent, après la première centrifugation, les cellules doivent être remises en suspension dans un milieu sans sérum ou une solution de Hanks et lavées deux fois, chaque fois centrifugées à basse vitesse et le surnageant éliminé pour garantir que la plupart des enzymes résiduelles sont éliminées et que le taux de survie cellulaire est amélioré.

Concentration cellulaire et optimisation des conditions de culture

Avant l'inoculation, les cellules peuvent être davantage concentrées par centrifugation à basse vitesse pour augmenter la densité d'inoculation. Une densité cellulaire appropriée facilite non seulement l'interaction entre cellules, mais favorise également l'adhésion et la prolifération, augmentant ainsi le taux de survie des cellules primaires et le taux de réussite de la culture.

Les centrifugeuses réfrigérées à basse vitesse jouent non seulement un rôle clé dans la séparation des cellules primaires, mais sont également largement utilisées dans de nombreux domaines tels que la culture cellulaire, la médecine clinique, les produits biopharmaceutiques, la biologie moléculaire et le traitement du sang. Sa faible vitesse et ses capacités de contrôle de température efficaces en font un choix idéal pour le traitement d'échantillons sensibles à la température. Lors de l'utilisation d'une centrifugeuse, les paramètres de centrifugation et les procédures opératoires doivent être raisonnablement optimisés pour améliorer le taux de réussite de l'expérience et garantir l'intégrité de l'échantillon et la stabilité des résultats expérimentaux.