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Le lecteur de microplaques est un instrument de laboratoire courant, largement utilisé dans la mesure de la concentration en protéines et d'autres expériences biochimiques. Son principe est basé sur la méthode d'absorption de la lumière, qui détermine la concentration de la substance cible dans l'échantillon en mesurant l'absorption de la lumière de la solution d'échantillon à une longueur d'onde spécifique. Lors de l'utilisation d'un lecteur de microplaques, la protéine ou d'autres substances biochimiques de l'échantillon réagissent généralement avec un réactif de couleur spécifique pour générer un produit ayant des caractéristiques d'absorption de lumière spécifiques. L'instrument émet une lumière d'une longueur d'onde spécifique et, après avoir traversé l'échantillon, le détecteur mesure l'intensité de la lumière transmise.

En comparant l'absorbance avec la courbe standard, la concentration de la substance cible dans l'échantillon peut être calculée avec précision. La courbe standard est généralement constituée d'une série d'échantillons standard de concentrations connues, et son absorbance est utilisée pour étalonner le lecteur de microplaques afin de garantir l'exactitude des résultats de mesure. La haute sensibilité et la haute précision du lecteur de microplaques en font un outil essentiel pour les expériences biochimiques telles que la mesure de la concentration en protéines, l'analyse de l'activité enzymatique et les expériences de prolifération cellulaire.

Les protéines sont des biomacromolécules importantes dans les organismes vivants et la détermination de leur teneur revêt une grande importance dans la recherche en sciences biologiques et dans l'industrie biotechnologique. Le lecteur de microplaques est un instrument de précision utilisé pour détecter la concentration de biomolécules, qui analyse quantitativement les molécules cibles en fonction du changement de couleur produit par les réactions catalysées par des enzymes.

Welso a présenté la méthode BCA (méthode colorimétrique) pour déterminer la concentration en protéines. Le principe est que la protéine réagit avec les ions cuivre (Cu²⁺) dans des conditions alcalines pour former un complexe violet-bleu. Le complexe présente un pic d'absorption caractéristique à une longueur d'onde spécifique (généralement 562 nm) et son absorbance est linéairement proportionnelle à la concentration en protéines dans l'échantillon. En mesurant l'absorbance avec un lecteur d'enzymes et en la comparant à la courbe standard, la concentration en protéines dans l'échantillon peut être calculée avec précision. Cette méthode est largement utilisée pour la détermination rapide de la concentration en protéines en raison de sa grande sensibilité et de son fonctionnement simple.

Objectif expérimental

Maîtriser l’utilisation d’un lecteur de microplaques et se familiariser avec son processus de fonctionnement et ses fonctions.

Apprenez les principes de base et les étapes de fonctionnement de l’analyse quantitative des protéines.

Mesurer la concentration en protéines par la méthode BCA et vérifier l'exactitude des résultats expérimentaux.

Matériel et instruments expérimentaux 

Matériel

Solution protéique standard (par exemple, albumine sérique bovine)

Échantillon de solution protéique à tester

Solution BCA

Microplaque à 96 puits

Réactifs 

Sulfate de cuivre

Sulfate de sodium

Hydroxyde de sodium, etc.

Instruments 

Lecteur ELISA

Balance électronique

Pipeteurs

Bain-marie thermostaté

Étapes expérimentales 

●Configuration des courbes standard

A. Préparez la solution BCA conformément aux instructions du kit.

B. Diluez la solution étalon de protéines avec de l'eau déionisée à différents gradients de concentration (tels que 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ug/mL)

C. Ajoutez la solution étalon diluée à chaque microplaque à 96 puits, 100 μL par puits.

D. Ajoutez 100 μL de solution BCA à chaque puits et mélangez bien.

E. Placez la microplaque dans un lecteur ELISA et mesurez la valeur d'absorption à une longueur d'onde de 562 nm.

Établissez une courbe étalon avec la concentration en protéines comme axe horizontal et la valeur d'absorption comme axe vertical.

●Détermination de l'échantillon

A. Diluer l'échantillon de protéines à tester avec de l'eau déionisée jusqu'à obtenir une concentration appropriée.

B. Ajouter les échantillons dilués dans une microplaque à 96 puits, 100 μL dans chaque puits.

C. Ajouter 100 μL de solution BCA dans chaque puits et bien mélanger.

D. Placer la microplaque dans un lecteur ELISA et mesurer la valeur d'absorption à une longueur d'onde de 562 nm.

●Analyse des résultats

En fonction de la valeur d'absorption de l'échantillon mesuré, recherchez la protéine correspondante sur la courbe standard, puis calculez la concentration en protéines de la solution d'échantillon en fonction du volume de l'échantillon.

La méthode BCA est une méthode d'analyse quantitative des protéines couramment utilisée, qui présente les avantages d'une utilisation simple, d'une sensibilité élevée et d'une forte spécificité. Au cours de l'expérience, une attention particulière doit être accordée à la prévention de la dénaturation, de la dégradation et de la contamination des protéines afin de garantir l'exactitude des résultats. Les résultats de cette expérience montrent que la méthode BCA peut déterminer efficacement la concentration des échantillons de protéines et fournir des données fiables pour les recherches ultérieures sur les protéines.

Cette expérience a utilisé avec succès l’instrument ELISA et la méthode BCA pour déterminer la concentration d’échantillons de protéines, a vérifié la faisabilité de la méthode et a fourni une référence importante pour l’analyse quantitative des protéines.