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Los macrófagos son fundamentales para el sistema inmunológico del cuerpo, ya que desempeñan un papel importante en la fagocitación de patógenos, la regulación de las respuestas inmunitarias y el mantenimiento de la homeostasis tisular. A través del método de extracción primaria, los investigadores pueden evitar los cambios genéticos y el deterioro funcional que pueden ser causados por múltiples pases de líneas celulares, y obtener directamente macrófagos con actividad biológica completa de organismos vivos, lo que sienta una base sólida para experimentos posteriores.

Los macrófagos primarios derivados de la médula ósea suelen ser redondos u ovalados cuando no están estimulados, con tamaños celulares variables, núcleos pequeños, en su mayoría redondos u ovalados, cromatina laxa y nucléolos evidentes. Las vacuolas y las sustancias granulares son comunes en el citoplasma y estas estructuras están estrechamente relacionadas con su función fagocítica.

Las centrífugas desempeñan un papel fundamental en el proceso de extracción de células BMDM. A través del paso de centrifugación, podemos separar y precipitar eficazmente las células para obtener macrófagos de médula ósea de alta calidad. El proceso de centrifugación no solo ayuda a eliminar las impurezas, sino que también garantiza la pureza y la actividad de las células, que es un eslabón clave indispensable en el proceso de extracción.

A continuación se detallan los pasos y precauciones para el método de extracción primaria de macrófagos utilizando ratones como ejemplo:

Preparación del material experimental

Animales experimentales: ratones C57BL/J

Reactivos: medio de cultivo DMEM con alto contenido de glucosa que contiene 10 % de FBS, 75 % de etanol, PBS estéril.

Equipo experimental: jeringas desechables, instrumentos quirúrgicos, tubos de centrífuga, centrífugas, placas de cultivo celular o matraces de cultivo, etc.

Pasos experimentales

●Anestesia y sacrificio: después de anestesiar a los ratones, se los sacrificó de manera rápida y humanitaria mediante dislocación, siguiendo la ética de los experimentos con animales y minimizando el dolor de los ratones.

●Desinfección de la superficie: sumerja a los ratones en un vaso de precipitados que contenga etanol al 75 % durante 5 minutos. Después de una desinfección completa, use una toalla de papel limpia para absorber el exceso de alcohol.

●Tratamiento de la piel y las articulaciones: use tijeras esterilizadas para cortar una pequeña incisión en la parte posterior del ratón, rasgue la piel hasta la articulación de la pantorrilla con las manos desnudas y retire la articulación del pie y la piel.

●Muestreo de las patas y desinfección secundaria: use tijeras esterilizadas para desmontar con cuidado las extremidades traseras del trocánter mayor en la raíz del muslo para evitar fracturas. Después de quitar los músculos, sumerja los huesos de las patas en una placa de cultivo con etanol al 75 % durante 5 minutos.

●Después de 5 minutos, saque los huesos de la pierna de la placa de cultivo de etanol, colóquelos en una nueva placa de cultivo de etanol y muévalos a la mesa limpia para proporcionar un ambiente estéril para los experimentos posteriores.

Extracción e inducción de células BMDM

● Pretratamiento de los huesos de las patas: transfiera los huesos de las patas de ratón empapados en etanol a un recipiente lleno de PBS frío, sumerja por completo y enjuague el etanol en la superficie del hueso con PBS, repita 3 veces para asegurar una limpieza completa.

● Extracción de médula ósea: separe el fémur y la tibia limpios y corte ambos extremos con tijeras esterilizadas. Use una jeringa de 1 ml para absorber el medio de inducción frío, apunte al extremo del hueso y sople para extraer la médula ósea, y sople y lave repetidamente aproximadamente 3 veces hasta que no haya residuos de médula ósea roja evidentes en el hueso de la pata.

● Dispersión y filtración de células: use una pipeta de 5 ml para soplar suavemente el medio que contiene células de médula ósea para dispersar los grupos de células. Filtre la suspensión a través de un filtro de células de 70 μm para eliminar las impurezas y transfiera el filtrado a un tubo de centrífuga de 15 ml.

● Centrifugación y resuspensión: Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos y desechar el sobrenadante. Añadir tampón de lisis de glóbulos rojos para resuspender las células, dejar reposar durante 5 minutos y luego centrifugar a la misma velocidad durante 5 minutos y desechar el sobrenadante. Finalmente, resuspender el pellet celular con medio de inducción frío.

● Cultivo celular y reemplazo del medio: Sembrar las células según sea necesario. El tercer día, se reemplazó la mitad del medio de cultivo para mantener un entorno de cultivo estable; el quinto día, se reemplazó una cantidad completa de medio de cultivo fresco para satisfacer las necesidades de crecimiento y diferenciación celular; el séptimo día, las células alcanzaron un estado utilizable.

Notas

●Las células BMDM no se pueden pasar: debido a las características biológicas especiales de las células BMDM, no son adecuadas para operaciones de paso.

●Evite la digestión con tripsina: la tripsina se utiliza a menudo para separar las células adherentes, pero no es adecuada para las células BMDM. La actividad proteolítica de la tripsina destruirá la membrana celular y las proteínas clave, lo que provocará la inactivación celular y la inutilización para experimentos posteriores. Por lo tanto, no utilice tripsina para tratar las células BMDM.

●Se recomienda utilizar un raspador de células: debido a las limitaciones del paso y la digestión con tripsina, se recomienda utilizar un raspador de células para raspar suavemente las células BMDM.

●Evite los cambios frecuentes de los recipientes de cultivo: las células BMDM son frágiles y sensibles al medio ambiente. Se recomienda sembrarlas directamente para los experimentos después de la adquisición. Los cambios frecuentes de los recipientes de cultivo pueden causar alteraciones físicas, lo que provoca colisiones y tirones de células, lo que daña las células e interfiere con los resultados experimentales.

Lo anterior es el proceso detallado de extracción de células BMDM que será útil para los usuarios. En experimentos biológicos, Welso puede proporcionarle todos los instrumentos experimentales que necesita. Vale la pena mencionar especialmente que nuestra serie de centrífugas es un asistente indispensable en el experimento. Nos enfocamos en proporcionar productos centrífugos de alta calidad a clientes globales, incluidas centrífugas de baja velocidad, centrífugas de alta velocidad, centrífugas refrigeradas, minicentrífugas y centrífugas de piso de gran capacidad. Si está interesado en nuestros productos, comuníquese con nosotros a tiempo y obtendrá la mejor cotización.