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En los experimentos de biología molecular y biología celular, la extracción de proteínas nucleares de alta pureza es un paso clave en el estudio de procesos nucleares como la regulación genética, la actividad de los factores de transcripción y la estructura de la cromatina. Debido a la diferencia en la distribución entre las proteínas nucleares y las proteínas citoplasmáticas, para garantizar la precisión de los datos experimentales, se requiere un método de extracción de proteínas nucleares con baja contaminación cruzada y fácil operación para obtener muestras de proteínas nucleares de alta pureza. Además, las proteínas nucleares son sensibles al entorno externo y se debe prestar especial atención a las condiciones de operación durante el proceso de extracción, como el control de la temperatura y el uso de inhibidores de proteasas, para mantener la actividad de las proteínas y evitar la degradación.

Es particularmente importante elegir el método de extracción de proteínas nucleares adecuado para las diferentes necesidades experimentales. Por ejemplo, para las proteínas altamente expresadas en el núcleo, como HIF1-α y TWIST, se recomienda utilizar un kit de extracción de proteínas nucleares o un tampón de lisis de proteínas nucleares dedicado para la extracción. Estos métodos no solo optimizan los pasos de la operación, sino que también reducen de manera efectiva la contaminación cruzada entre el citoplasma y las proteínas nucleares, lo que proporciona una base de muestra confiable para experimentos posteriores (como Western Blot, inmunoprecipitación, etc.).

A continuación se presentan dos métodos de extracción de proteínas nucleares relativamente fáciles de usar:

Para las proteínas con alta expresión en el núcleo, como HIF1-α y TWIST, se debe utilizar un kit especial de extracción de proteínas nucleares o un tampón de lisis de proteínas nucleares para la extracción.

Pasos de extracción de proteínas nucleares (método de molienda por homogeneización)

Preparación

Antes del experimento de extracción de proteínas nucleares, se deben preparar con anticipación los reactivos y tampones pertinentes para garantizar que el proceso experimental se desarrolle sin problemas. A continuación, se detalla la fórmula y el uso de la solución de colorante azul tripán y el tampón:

Fórmula de la solución de colorante azul tripán

Preparación de la solución madre: Pese una cantidad adecuada de polvo de azul tripán y disuélvala en 10 ml de agua bidestilada para preparar una solución madre de azul tripán al 4 % (p/v).

Dilución de la solución de trabajo: Utilice el tampón PBS para diluir la solución madre 10 veces para obtener una solución de trabajo con una concentración del 0,4 %.

Uso: Mezcle una solución de trabajo de azul tripán al 0,4 % y una suspensión celular en un volumen de 1:1 para el recuento de células o la detección de la actividad celular.

Fórmula del tampón A (tampón de lisis celular)

Ingredientes:

10 mM de HEPES (pH 7,9, 4 °C)

1,5 mM de MgCl₂

10 mM de KCl

0,5 mM de DTT (ditiotreitol)

Si necesita evitar que la degradación de las proteínas plasmáticas afecte a las proteínas nucleares, puede agregar 1 mM de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo)

Función:

Se utiliza para la lisis de la membrana celular, la liberación de los núcleos celulares y para garantizar la integridad del núcleo celular.

Fórmula del tampón B (tampón de extracción de proteínas nucleares)

Ingredientes:

20 mM HEPES (pH 7,9)

25 % (v/v) de glicerol

0,42 M NaCl

1,5 mM MgCl₂

0,2 mM EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)

0,5 mM PMSF

0,5 mM DTT

Función:

Romper la membrana nuclear y liberar proteínas nucleares manteniendo la estabilidad y la actividad de las proteínas.

Pasos para la extracción de proteínas nucleares

Recolección de células

● Digerir las células del matraz y recolectarlas en microtubos.

● Centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.

● Lavar el precipitado celular 3 veces con tampón PBS para asegurar que se eliminen las impurezas residuales.

Preparación para la lisis celular

● Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante. Agregar 5 veces el volumen del tampón A preenfriado (por ejemplo, agregar 100 μL de tampón A por cada 20 μL de precipitación celular), pipetear para mezclar y suspender completamente las células.

● Colocar la suspensión celular en hielo durante 10 min, luego centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 °C.

Liberación del núcleo

● Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, agregue nuevamente 25 veces el volumen del tampón A preenfriado y pipetee suavemente para resuspender las células.

● Transfiera la suspensión celular a un homogeneizador Dounce para homogeneizar.

Monitoreo de la homogeneización

● Durante el proceso de homogeneización, tome una pequeña cantidad de suspensión celular y mézclela con un volumen igual de colorante azul tripán al 0,4 %.

● Observe la ruptura de la membrana celular bajo un microscopio:

● Si la mayoría de las células están teñidas de azul, significa que la membrana celular se ha roto y detenga la homogeneización.

● Si no está completamente rota, continúe con la homogeneización.

Separación del núcleo celular y el citoplasma

● Cuando la mayoría de las células estén rotas, transfiera la suspensión celular a un tubo Eppendorf y centrifugue a 25 000 g durante 20 min a 4 °C.

Resultados de la centrifugación:

●El sobrenadante contiene componentes citoplasmáticos.

●El precipitado es el núcleo celular, que contiene proteína nuclear.

Extracción de proteína nuclear

●Recoger el precipitado después de la centrifugación, añadir 1 volumen de tampón B preenfriado y soplar suavemente para resuspender el precipitado.

●Transferir la suspensión a un homogeneizador de tejidos limpio y homogeneizar 30 veces para asegurar que la proteína nuclear se libere por completo.

Disolución y extracción de proteínas

●Transferir la suspensión homogeneizada a un tubo Eppendorf e incubarla en un agitador de baja velocidad en hielo durante 45 minutos para asegurar que la proteína nuclear se disuelva por completo.

●Centrifugarse a 25 000 g durante 30 minutos a 4 °C y recolectar el sobrenadante, que es la proteína nuclear purificada.

Pasos para la extracción de proteínas nucleares (método del kit)

Preparación

Preparación de reactivos

●Equilibrar el kit de extracción de proteínas nucleares a temperatura ambiente.

●Agregar PMSF al reactivo de extracción de proteínas plasmáticas y al reactivo de extracción de proteínas nucleares hasta una concentración final de 1 mM.

●Si la muestra contiene cisteína, agregar DTT a ambos reactivos hasta una concentración final de 0,5 mM.

Recolección y lavado de células

●Digerir las células de la pared del matraz y recolectarlas en un tubo Eppendorf.

●Centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.

●Lavar las células 1-2 veces con tampón PBS para eliminar las impurezas residuales.

Lisis celular

●Centrifugar a 300 g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.

● Agregue 5 volúmenes de reactivo de extracción de proteínas plasmáticas (p. ej., agregue 100 μL por cada 20 μL de pellet celular) y mezcle suavemente invirtiendo para asegurarse de que las células estén suspendidas de manera uniforme. Tenga cuidado de no agitar con vórtex para evitar una alteración celular excesiva.

Reacción de lisis

● Coloque la suspensión celular en hielo durante 20 minutos para lisar completamente las células.

Separación de proteínas citoplasmáticas

● Centrifugue a 250 g durante 20 minutos a 4 °C y deseche el sobrenadante.

● Agregue 2 volúmenes de reactivo de extracción de proteínas plasmáticas previamente enfriado al pellet celular y mezcle suavemente.

Liberación nuclear

● Use una jeringa con una aguja de 0,14 mm para soplar suavemente 5 veces para lisar completamente el pellet celular.

● Centrifugue a 10 000 g durante 30 minutos a 4 °C, recoja el sobrenadante (proteína citoplasmática) y deseche el pellet (proteína nuclear).

Extracción de proteína nuclear

●Agregue 50-100 μL de reactivo de extracción de proteína nuclear al precipitado de proteína nuclear y sople suavemente 5 veces con una jeringa con aguja de 0,14 mm de diámetro para asegurarse de que el precipitado esté completamente suspendido.

●Coloque la suspensión en un agitador de baja velocidad sobre hielo e incube durante 45 minutos para promover la disolución de la proteína nuclear.

Separación de nucleoproteínas

●Centrifuge a 16 000 g durante 5 minutos a 4 °C y recolecte el sobrenadante, que es la proteína nuclear celular extraída.

Pasos para la extracción de proteínas nucleares de tejido

Preparación de la muestra de tejido

●Pesar la muestra de tejido que se va a extraer.

●Cortar el tejido en trozos lo más pequeños posible para aumentar la eficiencia de homogeneización.

Homogeneización de tejido

●Agregar 300-500 μL de PBS por cada 50 mg de tejido.

●Usar un homogeneizador para homogeneizar completamente en condiciones de baño de hielo para asegurar que el tejido esté completamente disociado y forme una suspensión uniforme.

Centrifugación y recolección de precipitado

●Centrifugado a 500 g durante 3 min a 4 °C y desechar el sobrenadante en la suspensión de tejido.

●Recolectar el precipitado, que contiene células y orgánulos.

Extracción nuclear celular

●Agregar el precipitado recolectado a 200 μL de solución de extracción de proteína plasmática.

●Continuar extrayendo la proteína nuclear celular de acuerdo con los pasos de centrifugación anteriores.

La selección de un método adecuado debe determinarse en función de los objetivos experimentales, el tamaño de la muestra y el equipo experimental. En aplicaciones prácticas, los investigadores pueden seleccionar de forma flexible un método de extracción de proteínas nucleares adecuado en función de sus propias necesidades y las características específicas de la muestra. Independientemente del método que se elija, garantizar la precisión de la operación y las condiciones de baja temperatura es la clave para obtener proteínas nucleares de alta calidad.

Espero que este artículo pueda proporcionar referencias valiosas para todos, ayudar a optimizar el proceso de extracción de proteínas nucleares y mejorar la confiabilidad y repetibilidad del experimento.