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En el campo de la neurociencia, el estudio de las funciones de las células endoteliales cerebrovasculares y microvasculares es crucial para comprender los procesos fisiológicos normales del cerebro y los mecanismos del desarrollo de enfermedades. La tecnología de extracción primaria de células endoteliales microvasculares cerebrales se ha utilizado ampliamente, principalmente mediante la obtención de estas células a partir de modelos animales, para explorar en profundidad la estructura, la función y las interacciones de las células endoteliales. Esta tecnología proporciona una referencia importante para estudiar la patogénesis de enfermedades relacionadas y desarrollar fármacos terapéuticos específicos, y promueve el progreso científico en el campo de las enfermedades cerebrovasculares y las enfermedades neurodegenerativas.

Welso elaboró cuidadosamente un protocolo experimental para la separación y extracción de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) mediante el uso de una centrífuga de baja velocidad. El artículo tiene como objetivo proporcionar al personal de laboratorio una guía técnica concisa y fácil de entender, presentando en detalle los pasos y precauciones clave del experimento y ayudando a los investigadores científicos a dominar rápidamente los puntos clave de la operación. Esperamos que a través de este intercambio, podamos proporcionar orientación práctica y apoyo para la investigación en campos relacionados y acelerar el progreso de la investigación cerebrovascular y neurocientífica.

Introducción a los BMEC

Las células endoteliales microvasculares cerebrales primarias (BMEC) son un tipo importante de células aisladas, cultivadas y expandidas a partir del tejido cerebral. Se distribuyen principalmente en las paredes de los microvasos cerebrales y constituyen el componente central de la barrera hematoencefálica. Las BMEC desempeñan un papel vital en la regulación del intercambio de sustancias a través de la barrera hematoencefálica, manteniendo la estabilidad del entorno interno del cerebro y defendiéndolo contra la invasión de sustancias nocivas del mundo exterior. Son un modelo celular importante para estudiar la función cerebrovascular y los mecanismos de las enfermedades.

Materiales experimentales

Animales de experimentación: ratas SD (de 4 a 6 semanas de edad, machos)

Instrumentos y consumibles: tijeras quirúrgicas grandes, fórceps, tubos de centrífuga de 50 ml, placas de 6 pocillos

Reactivos y soluciones: etanol al 75 %, solución salina, colagenasa, BSA al 25 %, polilisina

Medio de cultivo: medio de cultivo basal DMEM/F12, medio de cultivo completo DMEM/F12

Instrumentos de laboratorio

Banco ultralimpio: para un funcionamiento estéril

Centrífuga de baja velocidad: para la separación de células

Incubadora de CO2: proporciona un entorno adecuado para el cultivo celular

Procedimientos experimentales

Manejo de animales de experimentación

●Después de anestesiar a las ratas, sumérjalas en etanol al 75 % durante aproximadamente 1 minuto para desinfectar la superficie.

Obtención del cerebro

●Corte la piel de la cabeza, extraiga rápidamente y por completo el cerebro y colóquelo en un medio de cultivo basal DMEM/F12 previamente enfriado.

Pañuelo de limpieza

● En una mesa limpia, extraiga los coágulos de sangre externos, las meninges y los vasos sanguíneos externos del cerebro (operar en una placa).

● Retire la materia blanca (estructura suelta) y conserve la materia gris (partes del cerebro izquierdo y derecho en forma de concha).

Lavado

●Lave repetidamente el tejido cerebral utilizando un medio de cultivo preenfriado a 4 °C para eliminar las impurezas.

Corte y procesamiento preliminar

●Corte el tejido cerebral en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm³ y transfiéralos a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml.

●Pique aún más el tejido y pipetee suavemente para dispersar los trozos de tejido.

Centrifugación

● Centrifugar a 900 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Añadir 5 ml de medio DMEM/F12 sin suero y mezclar bien con una pipeta.

● Añadir 10 ml de medio y 100 μl de colagenasa II y digerir a 37 °C durante 30 a 45 minutos.

Prepare una placa de 6 pocillos

●Al mismo tiempo, use 1 ml de polilisina para recubrir la placa de 6 pocillos e incube a 37 °C.

Tratamiento post-digestión

●Después de la digestión, agregar medio para neutralizar, centrifugar a 900 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.

●Agregar 15 mL de solución de BSA al 25 % y centrifugar a 2000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Extraer las células diana

● Después de la centrifugación, se puede observar la estratificación: el precipitado rojo oscuro en la capa inferior son las células microvasculares del cerebro.

● Enjuagar suavemente la poli-L-lisina en la placa de 6 pocillos con solución salina y repetir el lavado dos veces.

Resuspensión y cultivo de células

● Retire el sedimento de los microvasos cerebrales inferiores, agregue solución salina fisiológica y mezcle bien, luego centrifugue a 900 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.

● Resuspenda las células con medio completo DMEM/F12 nuevo, transfiéralas a una placa de 6 pocillos recubierta y cultívelas en una incubadora.

Mediante este procedimiento experimental, extrajimos y separamos con éxito células endoteliales microvasculares del cerebro de rata, lo que proporciona una base experimental sólida para futuras investigaciones. Durante todo el proceso, la centrífuga de baja velocidad es una herramienta clave que nos ayuda a separar células de manera eficiente y purificar la población de células objetivo. Para garantizar la precisión y la seguridad del experimento, Welso ha recopilado algunos puntos de funcionamiento de la centrífuga de baja velocidad para que los operadores puedan consultarlos.

Inspección y colocación del equipo

● Asegúrese de que la centrífuga esté colocada de forma estable sobre una mesa sólida para evitar la inestabilidad causada por la vibración o la inclinación.

● Revise el equipo antes de usarlo y concéntrese en verificar el rotor y los sellos para asegurarse de que no haya daños ni estén flojos.

Protección de la operación

● Use gafas protectoras y guantes de laboratorio durante la operación para evitar salpicaduras de líquidos que provoquen daños en la piel y los ojos.

Velocidad y carga

● Preste atención a la velocidad máxima y la carga máxima del equipo, y no exceda el rango de carga de la centrífuga.

● Seleccione la velocidad y el tiempo de centrifugación adecuados según los requisitos experimentales. La velocidad y el tiempo deben ajustarse según la densidad de la muestra, el propósito de la separación y el volumen para evitar afectar el efecto de separación debido a configuraciones de parámetros incorrectas.

Preparación y carga de la muestra

● Antes de que la muestra entre en la centrífuga, asegúrese de que el tubo de centrífuga, la tapa, el balde y el adaptador estén equilibrados con precisión en la balanza, la tolerancia de peso generalmente no es más de 1 g, el requisito de precisión no es más de 0,1 g y cumple con los requisitos del manual del equipo.

● Los materiales que se introducen en el tubo de centrífuga deben tener una densidad similar para evitar vibraciones causadas por una distribución desigual de la carga.

● La capacidad de la muestra no debe exceder el límite de capacidad máxima del tubo de centrífuga o del rotor para evitar que el equipo se desequilibre o se dañe.

● La muestra debe colocarse simétricamente en el rotor para garantizar que la fuerza centrífuga se distribuya de manera uniforme.

Especificaciones de funcionamiento

●Está prohibido abrir o cerrar la tapa cuando la centrífuga esté en funcionamiento para evitar lesiones accidentales.

●Después de la centrifugación, asegúrese de que el rotor se detenga por completo antes de abrir la tapa. Al extraer la muestra, tenga cuidado de evitar el contacto con el tubo de muestra a alta temperatura o las salpicaduras de líquido.

Limpieza y mantenimiento

●Después de su uso, limpie el equipo y el rotor a tiempo para mantenerlo limpio y evitar la contaminación o corrosión.

●Verifique periódicamente el estado de funcionamiento de la centrífuga para garantizar la estabilidad y la confiabilidad a largo plazo del equipo.

●Si sigue las precauciones anteriores, puede garantizar la seguridad de las operaciones experimentales y prolongar la vida útil del equipo.

Las centrífugas son esenciales en muchos experimentos de extracción y separación de células. Seguir estrictamente las especificaciones de funcionamiento de la centrífuga no solo puede garantizar la seguridad del experimento, sino que también prolonga la vida útil del equipo y garantiza la confiabilidad de los resultados experimentales. Welso es un proveedor profesional de centrífugas. Puede obtener más información sobre las características detalladas y los parámetros técnicos de las centrífugas de baja velocidad a través de nuestra página de productos. También lo invitamos a contactarnos en cualquier momento para obtener la cotización más adecuada.