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El ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) es una tecnología de inmunoensayo basada en la unión específica de antígeno y anticuerpo. Su principio básico es fijar el antígeno o anticuerpo de una concentración específica en la superficie de una microplaca de poliestireno mediante adsorción física, luego agregar la muestra a analizar y utilizar el grado de desarrollo de color producido por la reacción entre la etiqueta enzimática y el sustrato para reflejar indirectamente la presencia o ausencia o la cantidad del antígeno o anticuerpo que se está analizando.

Como un tipo de tecnología de inmunomarcaje (incluida la tecnología de inmunofluorescencia, la tecnología inmunoradiométrica, la tecnología de inmunoenzimas y la tecnología de oro inmunocoloidal), la tecnología ELISA se ha utilizado ampliamente en investigaciones científicas y experimentos clínicos debido a sus características de detección rápida, sensible, cualitativa o cuantitativa.

El ELISA es uno de los métodos experimentales más utilizados en la investigación de biología molecular, inmunología y biología celular, pero en la práctica, las personas a menudo se enfrentan a diversas dificultades experimentales. Por ejemplo, en los experimentos ELISA, un alto nivel de blanqueo es uno de los problemas comunes, que no solo afecta la precisión de los resultados experimentales, sino que también puede interferir con la confiabilidad de los datos. Por lo tanto, es particularmente importante comprender en profundidad las razones del alto nivel de blanqueo y tomar medidas de optimización efectivas.

Un valor de blanco alto se refiere a un aumento anormal del valor de absorbancia del control negativo o del blanco en el experimento ELISA. Normalmente, el valor de absorbancia del pocillo negativo debe ser inferior a 0,1. Un valor de fondo demasiado alto interferirá con los resultados experimentales, reducirá la precisión y la fiabilidad de los datos y hará imposible evaluar con precisión el contenido real del antígeno o anticuerpo en la muestra.

Las causas comunes incluyen:

● El plato no está limpio

Solución:

▼Lavar bien

Un tiempo de lavado insuficiente provocará residuos de anticuerpos, lo que provocará la coloración del control negativo.

Intente prolongar el tiempo de lavado, aumentar la cantidad de lavados y agregar una cantidad adecuada de surfactante (como Tween-20, 0,05 %) a la solución de lavado.

Al lavar la placa en cada paso, asegúrese de que el lavado sea minucioso y golpee la placa con fuerza hasta que no quede líquido residual evidente en el pocillo.

▼Evite la contaminación cruzada

Al desechar la solución de lavado o incubar los anticuerpos, tenga cuidado de evitar la contaminación cruzada entre los pocillos.

Las puntas de pipeta deben usarse una sola vez siempre que sea posible para evitar la contaminación causada por el uso repetido.

El papel de filtro utilizado para golpear la placa no debe reutilizarse para evitar la contaminación secundaria.

● La concentración de anticuerpos o reactivos es demasiado alta

Motivo: La concentración de anticuerpos, anticuerpos secundarios marcados con enzimas o sustrato cromogénico es demasiado alta, lo que da como resultado una mayor reacción inespecífica y una mayor señal de fondo.

Solución:

▼Optimizar la concentración de anticuerpos: diluir el anticuerpo a una concentración de trabajo adecuada para evitar una sobredosis.

▼Controlar la concentración de reactivos: ajustar estrictamente la concentración del anticuerpo secundario marcado con enzima y del sustrato cromogénico para evitar una concentración excesiva.

▼Realizar un experimento de dilución en gradiente: diluir gradualmente a través de experimentos preliminares para determinar la concentración óptima de cada reactivo y reducir la interferencia del blanco.

● Bloqueo incompleto

Motivo: La solución de bloqueo (como BSA) puede reaccionar de forma cruzada con el anticuerpo, lo que da como resultado un aumento de la señal de fondo. Si la concentración de la solución de bloqueo es demasiado baja o el tiempo de bloqueo es demasiado corto, el bloqueo puede no ser completo, lo que hace que el anticuerpo se una de forma no específica a la placa ELISA, lo que aumenta el valor de fondo.

Solución:

▼Utilice una solución de bloqueo adecuada y ajuste la concentración de la solución de bloqueo.

▼El tiempo de bloqueo debe ser suficiente, generalmente de 1 a 2 horas (temperatura ambiente) o durante la noche a 4 °C.

▼Asegúrese de lavar los pocillos de la placa después del bloqueo para eliminar el exceso de solución de bloqueo.

●La reacción de color es demasiado larga

Motivo: debido a una optimización inadecuada del sistema, la reacción de color de la muestra es débil. Para compensar esta deficiencia, se extiende el tiempo de reacción de color. El largo tiempo de reacción de color conduce a un aumento de las reacciones no específicas del sustrato.

Solución:

▼Se debe optimizar el sistema de detección y se deben ajustar las concentraciones del recubrimiento, el anticuerpo de detección y el sustrato para garantizar reacciones sensibles y específicas.

▼Acortar el tiempo de reacción de color, generalmente no más de 15 minutos, para garantizar la precisión de los resultados experimentales y evitar interferencias de blanco.

● Contaminación o degradación de reactivos

Motivo: La contaminación puede ocurrir durante la preparación o el almacenamiento de reactivos y tampones, lo que resulta en un aumento del blanco.

Solución:

▼ Utilice reactivos recién preparados para evitar la contaminación cruzada.

▼ Utilice soluciones filtradas para garantizar la pureza de los reactivos.

▼ Verifique las fechas de vencimiento de los anticuerpos, sustratos, soluciones de lavado y tampones para evitar el uso de reactivos deteriorados.

● Temperatura y factores ambientales

Motivo: Una temperatura o una humedad demasiado altas provocarán reacciones no específicas intensificadas, lo que dará como resultado un aumento de la detección en blanco

Solución:

▼ Verifique la incubadora para asegurarse de que la temperatura de incubación sea estable a 37 °C e incube de acuerdo con el tiempo de reacción indicado en las instrucciones.

▼ Evite exponer los pocillos de la placa a altas temperaturas o luz intensa durante un tiempo prolongado.

Los instrumentos y equipos son la base del éxito de los experimentos ELISA. Los equipos relacionados que se utilizan comúnmente incluyen pipetas, lectores de microplacas, lavadores de placas e incubadoras. Todos los equipos deben inspeccionarse y calibrarse periódicamente para garantizar la precisión y exactitud. Welso proporciona equipos de alta calidad necesarios para diversos experimentos ELISA. No dude en ponerse en contacto con nosotros para obtener más información.