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Las células con función trofoblástica se denominan trofoblastos, que se originan a partir del trofoblasto fuera del embrión y son un vínculo clave en un embarazo normal. Después de la implantación del embrión, los trofoblastos se dividen, se multiplasian y se diferencian para formar citotrofoblastos vellosos (VECT) y citotrofoblastos vellosos (VCT) con características biológicas claramente diferentes.

El principio básico del aislamiento y cultivo de los trofoblastos extravellosos vellosos humanos es que el EVCT tiene la capacidad de invadir, agregarse en la parte profunda de la decidua uterina para formar islas y está en contacto más cercano con las células de la decidua uterina, que es una parte importante del microambiente inmunológico materno y fetal.

El tejido velloso se seleccionó de la decidua y se filtró mediante digestión enzimática, luego se trituró y filtró, y se realizó una centrifugación en gradiente de densidad, y la capa de densidad del 40% se absorbió de acuerdo con la densidad de las células para obtener células del trofoblasto, y el EVCT se purificó aún más mediante cultivo a corto plazo en diferentes momentos.

De acuerdo con la morfología, fenotipo y características funcionales de las células, las células fueron identificadas, aisladas y purificadas mediante inmunohistoquímica o anticuerpos fluorescentes que simultáneamente marcaron los antígenos de superficie celular para la clasificación por citometría de flujo, lo que constituye una base para una discusión en profundidad de las funciones biológicas del trofoblasto.

Reactivos e instrumentos

Reactivo:

Solución de PBS, solución de D-Hanks, lisado de glóbulos rojos

Medio de cultivo DMEM/F12, suero bovino fetal, tripsina

Colagenasa tipo IV, DNasa tipo I, fibronectina (FN)

Colágeno tipo IV, Matrigel, solución madre de Percoll, antibióticos

Instrumento:

Tijeras oftálmicas, pinzas, pantallas de diferentes tamaños (malla 80, malla 300)

Todo tipo de placas de Petri, mangos de jeringas, tubos de centrífuga de plástico de diferentes especificaciones

Tubos EP de 1,5 ml, pipetas, centrífuga refrigerada de baja velocidad de sobremesa Welso WLR600

Columnas de clasificación de esferas y polos magnéticos, incubadoras de CO2, agitadores de baño de agua, citómetros de flujo

Procedimiento experimental

Los pasos básicos para el aislamiento y cultivo de trofoblastos extravellosos humanos se pueden dividir en los siguientes pasos:

1. Preparación de reactivos

(1) Solución de colágeno tipo IV: disuelva el colágeno tipo IV con ácido acético glacial al 0,25 % y disuélvala completamente a 4 °C durante la noche, con una concentración final de 2,0 mg/ml. Al utilizarla, la placa se envasó a 6~10 μg/c㎡ y se dejó a 4 °C durante la noche. Las placas de cultivo celular recubiertas con colágeno tipo IV se pueden esterilizar durante la noche con irradiación UV o enjuagar con etanol al 75 %.

(2) Solución de FN: disolver 1 mg de polvo seco de FN en 1 ml de agua destilada estéril, dejar a temperatura ambiente durante 30 minutos para que se disuelva naturalmente y almacenar a una concentración de 1 mg/ml. Dividir en alícuotas de 20 μl/tubo y almacenar a -70 °C.

(3) Disolver 20 μl de solución FN en 1 ml de medio FD (concentración de 20 μg/ml), verter en una placa de Petri con un diámetro de 35 mm, incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos y desechar el medio.

Nota

Las placas de Petri recubiertas inmediatamente se pueden utilizar o almacenar a -20 °C, pero no más de 2 semanas.

2. El tejido decidual fresco se lavó tres veces con PBS 1x para eliminar los coágulos de sangre y las membranas fetales, y se obtuvo tejido velloso y se cortó en trozos de 1 mm3 con tijeras oftálmicas.

3. Añadir 0,25% de tripsina y 0,1% de DNasa I, digerir en un baño de agua a 37 °C con agitación suave durante 5 minutos, luego aspirar el digesto y desechar.

4. El tejido restante se digirió con 0,25 % de tripsina y 0,1 % de DNasa I en un baño de agua a 37 °C durante 10 minutos, se aspiró la digestión y se añadió 10 % de suero de ternera para finalizar la digestión. Repita esto 3 o 4 veces y recoja todo el sobrenadante.

5. El sobrenadante digerido rico en trofoblastos se filtró a través de un tamiz de malla 80 y malla 300 a su vez, se recogió el líquido filtrado, se centrifugó a 300 g durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante.

6. Los pellets celulares se resuspendieron y se sembraron en un gradiente de Percoll discontinuo (10%~70%, un gradiente por cada 10%) y se centrifugaron a 1000 g durante 20 minutos.

7. Absorber las células con una capa de densidad del 40 % (p = 1,048 ~ 1,062 g/ml) como trofoblastos y agregar medio de cultivo con alto contenido de glucosa DMEM que contenga 10 % de suero bovino fetal después del lavado.

8. Ajuste la densidad celular a 5x10/ml, siembre en una placa recubierta de colágeno tipo IV (o FN o Matrigel) e incube de manera adherente durante 10 minutos para eliminar los fibroblastos que se adhieren fácilmente. Incube en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 horas antes de cambiar el medio de cultivo por primera vez.

9. Después de 24 h, se observó el estado de crecimiento de las células con un microscopio de contraste de fases invertido. El EVCT puede migrar y agregarse, pero no se fusiona y la capacidad proliferativa es débil.

10. La identificación inmunohistoquímica de las células obtenidas se realizó con base en las características de vimentina negativa, CK7 positiva.

11. Después de ser marcados con anticuerpo de superficie anti-HLA-G, FACSAriaII clasificó y purificó las células del trofoblasto extravelloso de las vellosidades HLA-G+ con una pureza de >95%.

Nota

●El tejido velloso se puede digerir con 1 mg/ml de colagenasa IV y 0,1 mg/ml de DNasa I según las condiciones del laboratorio.

●El EVCT tiene una capacidad proliferativa débil y demasiados pasajes pueden provocar fácilmente la pérdida de ciertas características biológicas de las células, por lo que es importante reducir el número de pasajes en las células cultivadas.

●Tanto EVCT como VCT expresan CK7 y no expresan vimentina, y pueden identificarse mediante inmunohistoquímica c-erbB-2 para distinguir entre EVCT (positivo para c-erbB-2) y VCT (negativo para c-erbB-2).