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Las células primarias son células que se aíslan directamente de los tejidos. No solo mantienen la morfología de las células normales, sino que también conservan los marcadores biológicos y las funciones clave del organismo. En comparación con las líneas celulares, los datos experimentales que proporcionan las células primarias son más cercanos al entorno fisiológico real, por lo que son de gran valor en la investigación biomédica.

Debido a que sus propiedades biológicas son básicamente inalteradas, las células primarias pueden simular con mayor precisión las características de crecimiento del cuerpo y se han utilizado ampliamente en biología molecular, biología celular e investigación biomédica básica, como proteómica, genómica, investigación celular e investigación genética. Al mismo tiempo, también son modelos celulares ideales en el campo de los productos biofarmacéuticos y se utilizan ampliamente en la investigación de mecanismos de enfermedades, detección de fármacos, metabolismo de fármacos, evaluación toxicológica, investigación de fármacos contra el cáncer y desarrollo de tratamientos.

La extracción de células y el cultivo in vitro se refieren al proceso de aislar células de tejidos u órganos y cultivarlas en condiciones adecuadas. Los pasos específicos incluyen: obtener el tejido objetivo en condiciones estériles, usar enzimas digestivas como tripsina o colagenasa para disociar el tejido en una suspensión de células individuales, luego separar las células por centrifugación, filtración, etc., y finalmente cultivarlas en un entorno de cultivo adecuado para mantener su crecimiento y función.

A continuación, compartiremos los pasos específicos para el aislamiento de células primarias utilizando una centrífuga refrigerada de baja velocidad:

Pasos experimentales (método de cultivo por digestión)

Preparación y lavado de tejidos

Tome aproximadamente 1 cm³ de tejido objetivo en condiciones estériles, colóquelo en una placa o vaso de precipitados y enjuáguelo repetidamente con una cantidad adecuada de solución de Hanks para eliminar los residuos de sangre y el tejido conectivo.

Picado y pretratamiento del tejido

Utilice tijeras afiladas para picar el tejido en trozos pequeños de aproximadamente 0,5 mm × 1 mm, enjuague nuevamente con solución de Hanks y deseche la solución de lavado después de que los trozos de tejido se hayan asentado.

Digestión enzimática

Transfiera los trozos de tejido a un vaso cónico con un agitador magnético estéril preinstalado y agregue de 5 a 30 ml de tripsina o colagenasa.

Cubra bien con un tapón de goma y selle con papel de aluminio, y coloque en un agitador magnético en una incubadora a 37 °C.

Encienda el agitador y revuelva uniformemente. Use un microscopio para observar la dispersión celular durante el proceso de digestión.

Cuando la mayoría de las células se hayan disociado en un solo estado (alrededor de 10 a 20 minutos), agregue inmediatamente una cantidad adecuada de solución de Hanks para finalizar la digestión.

Filtración celular

Primero, filtre con una malla de acero inoxidable de 100 μm para eliminar el tejido no digerido o los grupos de células grandes.

Luego, filtre con una malla de acero inoxidable de 20 μm para obtener una suspensión de células individuales relativamente pura.

Centrifugación a baja velocidad y lavado de células

El filtrado se transfirió a un tubo de centrífuga y se centrifugó a 500 × g (aproximadamente 5 minutos).

Se descartó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con solución de Hanks para eliminar las enzimas digestivas residuales.

Las células se resuspendieron en un medio que contenía suero y se agitaron suavemente para preparar una suspensión celular.

Recuento e inoculación de células

Utilice un hemocitómetro para contar y determinar la concentración de la suspensión celular (normalmente 1×10⁵~3×10⁵ células/ml).

Inocule uniformemente las células en una placa de cultivo y cultívelas en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO₂.

Este método permite obtener células primarias de alta viabilidad y proporcionar un modelo celular confiable para experimentos posteriores. El uso de una centrífuga refrigerada de baja velocidad puede ayudar a mejorar la eficiencia de separación de células primarias al tiempo que garantiza la viabilidad celular, lo que proporciona muestras celulares de alta calidad para experimentos posteriores.

Notas

Enjuague de tejidos

Antes de la digestión, los bloques de tejido deben enjuagarse 2 o 3 veces para eliminar los efectos inhibidores de los iones de calcio, magnesio y suero sobre la tripsina y el EDTA.

Se puede utilizar una solución de Hanks u otro tampón adecuado para agitar o remover suavemente los bloques de tejido en la solución de enjuague, y esta última se puede desechar una vez que se hayan eliminado por completo las sustancias que interfieren para garantizar el efecto de la digestión enzimática.

El papel de las enzimas digestivas

La tripsina es una enzima proteolítica secretada por el páncreas. Actúa principalmente sobre los enlaces peptídicos que unen la lisina y la arginina, descomponiendo las proteínas en polipéptidos y aminoácidos más pequeños, lo que ayuda a las células a dispersarse.

La colagenasa se deriva de las bacterias y tiene una gran capacidad para hidrolizar el colágeno. Puede digerir eficazmente el tejido fibroso, el tejido epitelial e incluso algunos tejidos cancerosos.

Mejorar la tasa de supervivencia celular

Aumentar adecuadamente la densidad de siembra de células de cultivo primario puede promover la interacción entre células y acercarlas al entorno de crecimiento in vivo, mejorando así la tasa de supervivencia celular y promoviendo la adhesión y la proliferación.

El papel clave de la centrífuga en los experimentos de separación primaria de células

En el proceso de separación primaria de células, la centrífuga refrigerada de baja velocidad desempeña un papel vital, y se utiliza principalmente para el enriquecimiento celular, la eliminación de enzimas digestivas y desechos y la mejora de la tasa de supervivencia celular. Sus principales aplicaciones en los experimentos incluyen:

Enriquecimiento y recolección de células

Después de la digestión, el tejido se disocia en una suspensión de células individuales, pero puede estar mezclado con fragmentos de tejido digeridos de forma incompleta, residuos de enzimas digestivas y fragmentos de células. Al configurar correctamente la centrífuga refrigerada de baja velocidad, se pueden precipitar de manera efectiva las células intactas, se pueden eliminar las enzimas y los desechos del sobrenadante y se puede obtener una suspensión celular relativamente pura.

Lavar las células para eliminar las enzimas digestivas residuales

Las enzimas digestivas como la tripsina y la colagenasa pueden afectar el funcionamiento normal de las células o incluso ser tóxicas para ellas. Por lo tanto, después de la primera centrifugación, las células deben resuspenderse en un medio sin suero o en una solución de Hanks y lavarse dos veces, centrifugando cada vez a baja velocidad y descartando el sobrenadante para garantizar que se eliminen la mayoría de las enzimas residuales y se mejore la tasa de supervivencia celular.

Concentración celular y optimización de las condiciones de cultivo

Antes de la inoculación, las células pueden concentrarse aún más mediante centrifugación a baja velocidad para aumentar la densidad de inoculación. Una densidad celular adecuada no solo facilita la interacción entre células, sino que también promueve la adhesión y la proliferación, lo que aumenta la tasa de supervivencia de las células primarias y la tasa de éxito del cultivo.

Las centrífugas refrigeradas de baja velocidad no solo desempeñan un papel clave en la separación de células primarias, sino que también se utilizan ampliamente en muchos campos, como el cultivo celular, la medicina clínica, los productos biofarmacéuticos, la biología molecular y el procesamiento de sangre. Su baja velocidad y sus eficientes capacidades de control de temperatura las convierten en una opción ideal para el procesamiento de muestras sensibles a la temperatura. Al utilizar una centrífuga, los parámetros de centrifugación y los procedimientos operativos deben optimizarse razonablemente para mejorar la tasa de éxito del experimento y garantizar la integridad de la muestra y la estabilidad de los resultados experimentales.