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El lector de microplacas es un instrumento de laboratorio común que se utiliza ampliamente en la medición de la concentración de proteínas y otros experimentos bioquímicos. Su principio se basa en el método de absorción de luz, que determina la concentración de la sustancia objetivo en la muestra midiendo la absorción de luz de la solución de muestra a una longitud de onda específica. Cuando se utiliza un lector de microplacas, la proteína u otras sustancias bioquímicas en la muestra generalmente reaccionan con un reactivo de color específico para generar un producto con características específicas de absorción de luz. El instrumento emite luz de una longitud de onda específica y, después de pasar a través de la muestra, el detector mide la intensidad de la luz transmitida.

Al comparar la absorbancia con la curva estándar, se puede calcular con precisión la concentración de la sustancia objetivo en la muestra. La curva estándar suele estar formada por una serie de muestras estándar de concentraciones conocidas, y su absorbancia se utiliza para calibrar el lector de microplacas y garantizar la precisión de los resultados de la medición. La alta sensibilidad y precisión del lector de microplacas lo convierten en una herramienta esencial para experimentos bioquímicos como la medición de la concentración de proteínas, el análisis de la actividad enzimática y los experimentos de proliferación celular.

La proteína es una biomacromolécula importante en los organismos vivos y la determinación de su contenido es de gran importancia en la investigación científica biológica y en la industria biotecnológica. El lector de microplacas es un instrumento de precisión que se utiliza para detectar la concentración de biomoléculas y que analiza cuantitativamente las moléculas objetivo en función del cambio de color producido por las reacciones catalizadas por enzimas.

Welso compartió el método BCA (método colorimétrico) para determinar la concentración de proteínas. El principio es que la proteína reacciona con iones de cobre (Cu²⁺) en condiciones alcalinas para formar un complejo violeta-azul. El complejo tiene un pico de absorción característico en una longitud de onda específica (normalmente 562 nm), y su absorbancia es linealmente proporcional a la concentración de proteína en la muestra. Al medir la absorbancia con un lector de enzimas y compararla con la curva estándar, se puede calcular con precisión la concentración de proteína en la muestra. Este método se utiliza ampliamente para la determinación rápida de la concentración de proteína debido a su alta sensibilidad y su funcionamiento sencillo.

Propósito experimental 

Domine el uso de un lector de microplacas y familiarícese con su proceso de operación y funciones.

Aprenda los principios básicos y los pasos de operación del análisis cuantitativo de proteínas.

Mida la concentración de proteínas mediante el método BCA y verifique la precisión de los resultados experimentales.

Materiales e instrumentos experimentales 

Materiales

Solución proteica estándar (como albúmina sérica bovina)

Muestra de solución proteica que se va a analizar

Solución de BCA

Microplaca de 96 pocillos

Reactivos 

Sulfato de cobre

Sulfato de sodio

Hidróxido de sodio, etc.

Instrumentos 

Lector ELISA

Balanza electrónica

Pipetas

Baño de agua termostático

Pasos experimentales 

●Configuración de curvas estándar

A. Prepare la solución de BCA según las instrucciones del kit.

B. Diluya la solución estándar de proteína con agua desionizada a diferentes gradientes de concentración (como 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ug/mL)

C. Agregue la solución estándar diluida a cada microplaca de 96 pocillos, 100 μL por pocillo.

D. Agregue 100 μL de solución de BCA a cada pocillo y mezcle bien.

E. Coloque la microplaca en un lector ELISA y mida el valor de absorbancia a una longitud de onda de 562 nm

Establezca una curva estándar con la concentración de proteína como eje horizontal y el valor de absorbancia como eje vertical

●Determinación de la muestra

A. Diluya la muestra de proteína que se va a analizar con agua desionizada hasta lograr una concentración adecuada.

B. Agregue las muestras diluidas a una microplaca de 96 pocillos, 100 μL en cada pocillo.

C. Agregue 100 μL de solución de BCA a cada pocillo y mezcle bien.

D. Coloque la microplaca en un lector ELISA y mida el valor de absorbancia a una longitud de onda de 562 nm.

●Análisis de resultados

Con base en el valor de absorbancia de la muestra medida, busque la proteína correspondiente en la curva estándar y luego calcule la concentración de proteína de la solución de muestra en función del volumen de la muestra.

El método BCA es un método de análisis cuantitativo de proteínas de uso común que tiene las ventajas de una operación sencilla, una alta sensibilidad y una fuerte especificidad. Durante el experimento, se debe prestar especial atención a la prevención de la desnaturalización, degradación y contaminación de las proteínas para garantizar la precisión de los resultados. Los resultados de este experimento muestran que el método BCA puede determinar eficazmente la concentración de muestras de proteínas y proporcionar un respaldo de datos confiable para la investigación de proteínas posterior.

Este experimento utilizó con éxito el instrumento ELISA y el método BCA para determinar la concentración de muestras de proteínas, verificó la viabilidad del método y proporcionó una referencia importante para el análisis cuantitativo de proteínas.