Blog

Makrofagi su kritični u imunološkom sistemu tijela, igrajući važnu ulogu u fagocitiranju patogena, regulaciji imunoloških odgovora i održavanju homeostaze tkiva. Putem metode primarne ekstrakcije, istraživači mogu izbjeći genetske promjene i funkcionalni pad koji mogu biti uzrokovani višestrukim prolazom staničnih linija, te direktno dobiti makrofage s potpunom biološkom aktivnošću od živih organizama što postavlja čvrst temelj za naredne eksperimente.

Primarni makrofagi izvedeni iz koštane srži su obično okrugli ili ovalni kada nisu stimulirani, s različitim veličinama ćelija, malim jezgrama, uglavnom okruglim ili ovalnim, labavim kromatinom i očiglednim jezgrama. Vakuole i granularne supstance su česte u citoplazmi, a ove strukture su usko povezane sa njihovom fagocitnom funkcijom.

Centrifuge igraju vitalnu ulogu u procesu ekstrakcije BMDM ćelija. Kroz korak centrifugiranja, možemo efikasno odvojiti i precipitirati ćelije kako bismo dobili visokokvalitetne makrofage koštane srži. Proces centrifugiranja ne samo da pomaže u uklanjanju nečistoća, već i osigurava čistoću i aktivnost ćelija, što je nezamjenjiva ključna karika u procesu ekstrakcije.

Slijede detaljni koraci i mjere opreza za primarnu metodu ekstrakcije makrofaga koristeći miševe kao primjer:

Priprema eksperimentalnog materijala

Eksperimentalne životinje: C57BL/J miševi

Reagensi: DMEM medij za kulturu sa visokim sadržajem glukoze koji sadrži 10% FBS, 75% etanol, sterilni PBS.

Eksperimentalna oprema: špricevi za jednokratnu upotrebu, hirurški instrumenti, epruvete za centrifugiranje, centrifuge, ploče za ćelijske kulture ili tikvice za kulturu itd.

Eksperimentalni koraci

●Anestezija i ubijanje: Nakon anesteziranja miševa, oni su brzo i humano ubijeni dislokacijom, poštujući etiku eksperimenata na životinjama i minimizirajući bol miševa.

●Površinska dezinfekcija: Potopite miševe u čašu koja sadrži 75% etanola na 5 minuta. Nakon temeljne dezinfekcije, koristite čist papirni ubrus da upije višak alkohola.

● Tretman kože i zglobova: Upotrijebite sterilizirane makaze da izrežite mali rez na zadnjoj strani miša, golim rukama pokidajte kožu do zgloba potkoljenice i uklonite zglob i kožu stopala.

●Uzorkovanje nogu i sekundarna dezinfekcija: Koristite sterilisane makaze da pažljivo rastavite zadnje udove od većeg trohantera u korenu butine kako biste izbegli lomove. Nakon uklanjanja mišića, potopite kosti nogu u posudu za kulturu sa 75% etanola na 5 minuta.

●Nakon 5 minuta, izvadite kosti nogu iz posude za kulturu etanola, stavite ih u novu posudu za kulturu etanola i premjestite ih na čistu klupu kako biste osigurali sterilno okruženje za naredne eksperimente.

Ekstrakcija i indukcija BMDM ćelija

● Predtretman kostiju nogu: Prenesite kosti mišjeg nogu natopljene etanolom u posudu napunjenu hladnim PBS-om, potpuno uronite i isperite etanol na površini kosti PBS-om, ponovite 3 puta kako biste osigurali temeljno čišćenje.

● Ekstrakcija koštane srži: Odvojite očišćenu butnu kost i tibiju i isecite oba kraja sterilizovanim makazama. Upotrijebite špric od 1 mL da apsorbirate hladni indukcijski medij, ciljajte na kraj kosti i izduvajte koštanu srž, te duvajte i isperite uzastopno oko 3 puta dok ne bude vidljivih ostataka crvene koštane srži u kosti noge.

● Ćelijska disperzija i filtracija: Koristite pipetu od 5 mL da nežno uduvate medijum koji sadrži ćelije koštane srži da biste raspršili ćelijske nakupine. Filtrirajte suspenziju kroz ćelijski filter od 70 μm da biste uklonili nečistoće i prenesite filtrat u epruvetu za centrifugiranje od 15 mL.

● Centrifugiranje i resuspenzija: Centrifugirajte na 1500 rpm 5 minuta i bacite supernatant. Dodajte pufer za lizu crvenih krvnih zrnaca da resuspendirate ćelije, ostavite da odstoji 5 minuta, a zatim centrifugirajte na istoj brzini 5 minuta i bacite supernatant. Na kraju, resuspendirajte ćelijsku peletu sa hladnim indukcijskim medijumom.

● Zamjena ćelijske kulture i medijuma: Stavite ćelije na ploču prema potrebi. Trećeg dana, polovina podloge za kulturu je zamenjena da bi se održala stabilna sredina kulture; petog dana zamijenjena je puna količina svježe podloge za kulturu kako bi se zadovoljile potrebe rasta i diferencijacije stanica; sedmog dana ćelije su dostigle upotrebljivo stanje.

Bilješke

●BMDM ćelije se ne mogu proći: Zbog posebnih bioloških karakteristika BMDM ćelija, one nisu pogodne za operacije prolaza.

●Izbjegavajte probavu tripsina: Tripsin se često koristi za odvajanje adherentnih ćelija, ali nije pogodan za BMDM ćelije. Proteolitička aktivnost tripsina će uništiti staničnu membranu i ključne proteine, uzrokujući ćelijsku inaktivaciju i neupotrebljiv za naredne eksperimente. Stoga nemojte koristiti tripsin za liječenje BMDM stanica.

●Preporučuje se upotreba strugača za ćelije: Zbog ograničenja prolaza i varenja tripsina, preporučuje se upotreba strugača za ćelije za nežno struganje BMDM ćelija.

●Izbjegavajte česte promjene posuda za kulturu: BMDM ćelije su krhke i osjetljive na okolinu. Preporučljivo je da ih direktno obložite za eksperimente nakon akvizicije. Česte promjene posuda za kulturu mogu uzrokovati fizičke smetnje, uzrokujući kolizije i povlačenje stanica, čime oštećuju stanice i ometaju eksperimentalne rezultate.

Gore navedeno je detaljan proces ekstrakcije BMDM ćelija koji će biti od pomoći korisnicima. U biološkim eksperimentima, Welso vam može pružiti sve eksperimentalne instrumente koji su vam potrebni. Posebno je vrijedno spomenuti da je naša serija centrifuga nezaobilazan pomoćnik u eksperimentu. Fokusiramo se na pružanje visokokvalitetnih proizvoda za centrifuge globalnim kupcima, uključujući centrifuge male brzine, centrifuge velike brzine, hlađene centrifuge, mini centrifuge i podne centrifuge velikog kapaciteta. Ako ste zainteresovani za naše proizvode, kontaktirajte nas na vreme i dobićete najbolju ponudu.