Blog

U eksperimentima molekularne biologije i biologije ćelije, ekstrakcija nuklearnih proteina visoke čistoće je ključni korak u proučavanju nuklearnih procesa kao što su regulacija gena, aktivnost transkripcionog faktora i struktura hromatina. Zbog razlike u distribuciji između nuklearnih proteina i citoplazmatskih proteina, kako bi se osigurala točnost eksperimentalnih podataka, potrebna je metoda ekstrakcije nuklearnog proteina s niskom unakrsnom kontaminacijom i lakim radom za dobivanje uzoraka nuklearnog proteina visoke čistoće. Osim toga, nuklearni proteini su osjetljivi na vanjsko okruženje, a posebnu pažnju treba posvetiti radnim uvjetima tokom procesa ekstrakcije, kao što su kontrola temperature i upotreba inhibitora proteaze, kako bi se održala aktivnost proteina i izbjegla degradacija.

Posebno je važno odabrati odgovarajuću metodu ekstrakcije nuklearnog proteina za različite eksperimentalne potrebe. Na primjer, za proteine koji su visoko eksprimirani u jezgri kao što su HIF1-α i TWIST, preporučuje se korištenje kompleta za ekstrakciju nuklearnih proteina ili namjenskog pufera za lizu nuklearnog proteina za ekstrakciju. Ove metode ne samo da optimizuju operativne korake, već i efikasno smanjuju unakrsnu kontaminaciju između citoplazme i nuklearnih proteina, pružajući pouzdanu osnovu uzorka za naknadne eksperimente (kao što je Western Blot, imunoprecipitacija, itd.).

Evo dvije relativno jednostavne metode ekstrakcije nuklearnih proteina:

Za proteine sa visokom ekspresijom u jezgri, kao što su HIF1-α i TWIST, za ekstrakciju treba koristiti poseban komplet za ekstrakciju nuklearnog proteina ili pufer za lizu nuklearnog proteina.

Koraci ekstrakcije nuklearnih proteina (homogenizacijski metod mljevenja)

Priprema

Prije eksperimenta ekstrakcije nuklearnog proteina potrebno je unaprijed pripremiti relevantne reagense i pufere kako bi se osiguralo da se eksperimentalni proces odvija nesmetano. Slijedi detaljna formula i upotreba otopine Trypan Blue boje i pufera:

Formula otopine tripan plave boje

Priprema matične otopine: Odmjerite odgovarajuću količinu Trypan Blue praha i otopite je u 10 mL dvostruko destilovane vode da biste pripremili 4% (w/v) matičnu otopinu Trypan plavog.

Razblaživanje radne otopine: Koristite PBS pufer da razrijedite matičnu otopinu 10 puta kako biste dobili radnu otopinu koncentracije 0,4%.

Upotreba: Pomiješajte 0,4% radnu otopinu tripan plavog i ćelijsku suspenziju u zapremini 1:1 za brojanje ćelija ili detekciju ćelijske aktivnosti.

Pufer A formula (pufer za lizu ćelija)

Sastojci:

10 mM HEPES (pH 7,9, 4°C)

1,5 mM MgCl₂

10 mM KCl

0,5 mM DTT (ditiotreitol)

Ako trebate spriječiti da degradacija proteina plazme utječe na nuklearne proteine, možete dodati 1 mM PMSF (fenilmetilsulfonil fluorid)

Funkcija:

Koristi se za lizu ćelijskih membrana, oslobađanje ćelijskih jezgara i osiguravanje integriteta ćelijskog jezgra.

Pufer B formula (pufer za ekstrakciju nuklearnih proteina)

Sastojci:

20 mM HEPES (pH 7,9)

25% (v/v) glicerol

0,42 M NaCl

1,5 mM MgCl₂

0,2 mM EDTA (etilendiamintetraoctena kiselina)

0,5 mM PMSF

0,5 mM DTT

Funkcija:

Puknite nuklearnu membranu i oslobodite nuklearne proteine uz održavanje stabilnosti i aktivnosti proteina.

Koraci ekstrakcije nuklearnog proteina

Cell collection

● Provarite ćelije iz tikvice i sakupite ih u mikro epruvete.

● Centrifugirajte na 300 g 5 minuta na 4°C i bacite supernatant.

● Operite precipitaciju ćelije 3 puta sa PBS puferom kako biste osigurali da su zaostale nečistoće uklonjene.

Priprema za lizu ćelija

● Nakon centrifugiranja, bacite supernatant. Dodajte 5 puta veću zapreminu prethodno ohlađenog pufera A (na primjer, dodajte 100 μL pufera A za svakih 20 μL precipitacije ćelije), pipetom promiješajte i potpuno suspendirajte ćelije.

● Stavite suspenziju ćelija na led 10 minuta, a zatim centrifugirajte na 300 g 5 minuta na 4°C.

Oslobađanje jezgra

● Nakon centrifugiranja, bacite supernatant, ponovo dodajte 25 puta veću zapreminu prethodno ohlađenog pufera A i nežno pipetirajte da resuspendujete ćelije.

● Prenesite suspenziju ćelija u Dounce homogenizator za homogenizaciju.

Praćenje homogenizacije

● Tokom procesa homogenizacije, uzmite malu količinu suspenzije ćelija i pomešajte je sa jednakom zapreminom 0,4% tripan plave boje.

●Promatrajte rupturu ćelijske membrane pod mikroskopom:

●Ako je većina ćelija obojena plavom bojom, to znači da je ćelijska membrana pukla i zaustaviti homogenizaciju.

●Ako nije potpuno puknut, nastavite homogenizaciju.

Odvajanje ćelijskog jezgra i citoplazme

●Kada je većina ćelija puknuta, prenesite suspenziju ćelija u Eppendorf epruvetu i centrifugirajte na 25.000 g 20 minuta na 4°C.

Rezultati centrifugiranja:

●Supernatant sadrži citoplazmatske komponente.

●Talog je jezgro ćelije, koje sadrži nuklearni protein.

Ekstrakcija nuklearnih proteina

●Sakupite precipitat nakon centrifugiranja, dodajte 1 zapreminu prethodno ohlađenog pufera B i lagano duvajte da se talog resuspenduje.

●Prebacite suspenziju u čist homogenizator tkiva i homogenizujte 30 puta kako biste osigurali da se nuklearni protein potpuno oslobodi.

Otapanje i ekstrakcija proteina

●Prenesite homogenizovanu suspenziju u Eppendorf epruvetu i inkubirajte je u šejkeru male brzine na ledu 45 minuta kako biste osigurali da je nuklearni protein potpuno otopljen.

●Centrifugirajte na 25.000 g 30 minuta na 4°C i sakupite supernatant, koji je prečišćeni nuklearni protein.

Koraci ekstrakcije nuklearnog proteina (metoda kompleta)

Priprema

Priprema reagensa

●Uravnotežite komplet za ekstrakciju nuklearnog proteina na sobnu temperaturu.

●Dodajte PMSF u reagens za ekstrakciju proteina plazme i reagens za ekstrakciju nuklearnih proteina do konačne koncentracije od 1 mM.

●Ako uzorak sadrži cistein, dodajte DTT u oba reagensa do konačne koncentracije od 0,5 mM.

Sakupljanje i pranje ćelija

●Provarite ćelije sa zida tikvice i sakupite ih u Eppendorf epruvetu.

●Centrifugirajte na 300 g 5 minuta na 4°C i bacite supernatant.

●Operite ćelije 1-2 puta sa PBS puferom da biste uklonili zaostale nečistoće.

Liza ćelija

● Centrifugirajte na 300 g 10 minuta na 4°C i bacite supernatant.

● Dodajte 5 zapremina reagensa za ekstrakciju proteina plazme (npr. dodajte 100 μL na 20 μL ćelijske pelete) i lagano promiješajte okretanjem kako biste osigurali da su ćelije ravnomjerno suspendovane. Pazite da izbjegnete vrtlog kako biste spriječili pretjerano oštećenje stanica.

Reakcija lize

● Stavite suspenziju ćelija na led na 20 minuta da potpuno lizirate ćelije.

Odvajanje citoplazmatskog proteina

● Centrifugirajte na 250 g 20 minuta na 4°C i bacite supernatant.

● Dodajte 2 zapremine prethodno ohlađenog reagensa za ekstrakciju proteina plazme u ćelijsku peletu i lagano promešajte.

Nuklearno oslobađanje

● Koristite špric sa iglom od 0,14 mm da nežno dunite 5 puta da biste potpuno lizirali ćelijski pelet.

● Centrifugirajte na 10.000 g 30 minuta na 4°C, sakupite supernatant (citoplazmatski protein) i bacite pelet (nuklearni protein).

Ekstrakcija nuklearnih proteina

●Dodajte 50-100 μL reagensa za ekstrakciju nuklearnog proteina u talog nuklearnog proteina i lagano uduvajte 5 puta sa špricom sa iglom prečnika 0,14 mm kako biste osigurali da je precipitat potpuno suspendovan.

●Stavite suspenziju na šejker male brzine na ledu i inkubirajte 45 minuta kako biste podstakli rastvaranje nuklearnog proteina.

Odvajanje nukleoproteina

●Centrifugirajte na 16.000 g 5 minuta na 4°C i sakupite supernatant, koji je ekstrahovani ćelijski nuklearni protein.

Koraci ekstrakcije nuklearnog proteina tkiva

Priprema uzorka tkiva

●Izvagajte uzorak tkiva koji se ekstrahira.

●Isecite tkivo na manje komade kako biste povećali efikasnost homogenizacije.

Homogenizacija tkiva

●Dodajte 300-500 μL PBS za svakih 50 mg tkiva.

●Koristite homogenizator za potpunu homogenizaciju u uslovima ledene kupke kako biste osigurali da se tkivo potpuno disocira i formira jednoličnu suspenziju.

Centrifugiranje i sakupljanje taloga

●Centrifugirajte na 500 g 3 min na 4°C i bacite supernatant u suspenziju tkiva.

●Sakupite talog koji sadrži ćelije i organele.

Ekstrakcija nuklearnih ćelija

●Dodajte prikupljeni precipitat u 200 μL rastvora za ekstrakciju proteina plazme.

●Nastavite da ekstrahujete ćelijski nuklearni protein prema gore navedenim koracima centrifugiranja.

Odabir odgovarajuće metode treba odrediti na osnovu eksperimentalnih ciljeva, veličine uzorka i eksperimentalne opreme. U praktičnim primjenama, istraživači mogu fleksibilno odabrati odgovarajuću metodu ekstrakcije nuklearnog proteina na osnovu vlastitih potreba i specifičnih karakteristika uzorka. Bez obzira na to koju metodu odabrati, osiguravanje točnosti rada i niske temperature je ključ za dobivanje visokokvalitetnih nuklearnih proteina.

Nadam se da ovaj članak može pružiti vrijedne reference za svakoga, pomoći u optimizaciji procesa ekstrakcije nuklearnog proteina i poboljšati pouzdanost i ponovljivost eksperimenta.