Blog

U području neuroznanosti, proučavanje funkcija cerebrovaskularnih i mikrovaskularnih endotelnih stanica je ključno za razumijevanje normalnih fizioloških procesa mozga i mehanizama razvoja bolesti. Tehnologija ekstrakcije primarnih mikrovaskularnih endotelnih ćelija mozga široko se koristi, uglavnom dobijanjem ovih ćelija iz životinjskih modela, za duboko istraživanje strukture, funkcije i interakcija endotelnih ćelija. Ova tehnologija predstavlja važnu referencu za proučavanje patogeneze srodnih bolesti i razvoj ciljanih terapijskih lijekova, te promovira naučni napredak u oblasti cerebrovaskularnih bolesti i neurodegenerativnih bolesti.

Također je pažljivo sastavio eksperimentalni protokol za odvajanje i ekstrakciju moždanih mikrovaskularnih endotelnih stanica (BMEC) pomoću centrifuge male brzine. Članak ima za cilj da laboratorijskom osoblju pruži sažet i lako razumljiv tehnički vodič, koji detaljno predstavlja ključne korake i mjere predostrožnosti eksperimenta i pomaže naučnim istraživačima da brzo savladaju ključne točke operacije. Nadamo se da kroz ovu razmjenu možemo pružiti praktične smjernice i podršku za istraživanja u srodnim područjima i ubrzati napredak cerebrovaskularnih i neuronaučnih istraživanja.

Uvod u BMEC

Primarne moždane mikrovaskularne endotelne ćelije (BMEC) su važan tip ćelija izoliranih, kultiviranih i proširenih iz moždanog tkiva. Oni su uglavnom raspoređeni u zidovima moždanih mikrožila i čine jezgru krvno-moždane barijere. BMEC igraju vitalnu ulogu u regulaciji razmjene supstanci kroz krvno-moždanu barijeru, održavanju stabilnosti unutrašnjeg okruženja mozga i odbrani od invazije štetnih tvari iz vanjskog svijeta. Oni su važan stanični model za proučavanje cerebrovaskularne funkcije i mehanizama bolesti.

Eksperimentalni materijali

Eksperimentalne životinje: SD pacovi (stari 4-6 sedmica, mužjaci)

Instrumenti i potrošni materijal: velike kirurške makaze, pincete, epruvete za centrifugiranje od 50 mL, ploče sa 6 jažica

Reagensi i rastvori: 75% etanol, fiziološki rastvor, kolagenaza, 25% BSA, poli-lizin

Podloga za kulturu: DMEM/F12 bazalna podloga, DMEM/F12 kompletna podloga

Laboratorijski instrumenti

Ultra čista klupa: za sterilni rad

Centrifuga male brzine: za odvajanje ćelija

CO2 inkubator: pruža pogodno okruženje za ćelijsku kulturu

Eksperimentalni postupci

Rukovanje eksperimentalnim životinjama

●Nakon anesteziranja pacova, potopite ih u 75% etanolu oko 1 minut za dezinfekciju površine.

Dobivanje mozga

● Prerežite kožu na glavi, brzo i potpuno uklonite mozak i stavite ga u prethodno ohlađeni DMEM/F12 bazalni medij.

Maramice za čišćenje

● U čistoj klupi uklonite vanjske krvne ugruške, moždane ovojnice i vanjske krvne sudove mozga (operirajte u posudi).

● Uklonite bijelu tvar (labavu strukturu) i zadržite sivu materiju (lijevi i desni dijelovi mozga u obliku školjke).

Pranje

●Uzastopno perite moždano tkivo koristeći prethodno ohlađenu podlogu za kulturu na 4°C da biste uklonili nečistoće.

Rezanje i prethodna obrada

●Izrežite moždano tkivo na male komadiće od oko 1 mm³ i prenesite u sterilnu epruvetu za centrifugu od 50 mL.

●Dalje usitnite maramicu i nježno pipetirajte kako biste raspršili komadiće maramice.

Centrifugiranje

● Centrifugirajte na 900 o/min 4 minuta na sobnoj temperaturi i bacite supernatant. Dodajte 5 mL DMEM/F12 medijuma bez seruma i dobro promešajte pipetom.

● Dodajte 10 mL medijuma i 100 μL kolagenaze II i varite na 37°C 30 do 45 minuta.

Pripremite ploču sa 6 jažica

●U isto vrijeme, koristite 1 mL poli-lizina da obložite ploču sa 6 jažica i inkubirajte na 37°C.

Tretman nakon varenja

●Nakon digestije, dodajte medijum za neutralizaciju, centrifugirajte na 900 o/min 10 minuta na sobnoj temperaturi i bacite supernatant.

●Dodajte 15 mL 25% rastvora BSA i centrifugirajte na 2000 o/min 20 minuta na sobnoj temperaturi.

Ekstrahujte ciljne ćelije

● Nakon centrifugiranja vidljiva je stratifikacija: tamnocrveni precipitat u donjem sloju je mikrovaskularne ćelije mozga.

● Lagano isperite poli-L-lizin u ploči sa 6 jažica fiziološkim rastvorom i ponovite pranje dva puta.

Resuspenzija ćelija i kultura

● Uklonite sediment donjeg moždanog mikrosula, dodajte fiziološku otopinu i dobro promiješajte, a zatim centrifugirajte na 900 o/min 5 minuta na sobnoj temperaturi.

● Resuspendujte ćelije sa svežim DMEM/F12 kompletnim medijumom, prenesite na obloženu ploču sa 6 jažica i kultivišite u inkubatoru.

Kroz ovaj eksperimentalni postupak, uspješno smo ekstrahirali i odvojili mikrovaskularne endotelne stanice mozga štakora, dajući solidnu eksperimentalnu osnovu za daljnja istraživanja. Tokom cijelog procesa, centrifuga male brzine je ključni alat koji nam pomaže da efikasno odvojimo ćelije i pročistimo ciljnu ćelijsku populaciju. Kako bi osigurao tačnost i sigurnost eksperimenta, Welso je sastavio neke radne točke centrifuge male brzine za referencu operatera.

Pregled i postavljanje opreme

● Osigurajte da je centrifuga stabilno postavljena na čvrsti sto kako biste izbjegli nestabilnost uzrokovanu vibracijama ili nagibom.

● Provjerite opremu prije upotrebe i fokusirajte se na provjeru rotora i zaptivki kako biste osigurali da nema oštećenja ili labavosti.

Zaštita rada

● Nosite zaštitne naočare i laboratorijske rukavice tokom rada kako biste spriječili prskanje tekućine i oštećivanje kože i očiju.

Brzina i opterećenje

● Obratite pažnju na maksimalnu brzinu i maksimalno opterećenje opreme i nemojte prekoračiti opseg opterećenja centrifuge.

● Odaberite odgovarajuću brzinu i vrijeme centrifugiranja prema eksperimentalnim zahtjevima. Brzinu i vrijeme treba podesiti prema gustini uzorka, svrsi odvajanja i volumenu kako bi se izbjeglo utjecanje na učinak razdvajanja zbog nepravilnih postavki parametara.

Priprema uzorka i punjenje

● Prije nego što uzorak uđe u centrifugu, uvjerite se da su cijev za centrifugu, poklopac, kanta i adapter tačno izbalansirani na vagi, tolerancija težine općenito nije veća od 1 g, zahtjev za preciznost nije veći od 0,1 g i zadovoljava zahtjeve priručnika za opremu.

● Materijali napunjeni u cijev za centrifugu moraju imati sličnu gustinu kako bi se izbjegle vibracije uzrokovane neravnomjernom raspodjelom opterećenja.

● Kapacitet uzorka ne smije premašiti ograničenje maksimalnog kapaciteta centrifugalne cijevi ili rotora kako bi se spriječilo da oprema bude neuravnotežena ili oštećena.

●Uzorak treba postaviti simetrično u rotor kako bi se osiguralo da je centrifugalna sila ravnomjerno raspoređena.

Operativne specifikacije

●Zabranjeno je otvarati ili zatvarati poklopac dok centrifuga radi kako bi se izbjegle slučajne ozljede.

●Nakon centrifugiranja, uvjerite se da se rotor potpuno zaustavi prije otvaranja poklopca. Prilikom vađenja uzorka, pazite da izbjegnete kontakt sa visokotemperaturnom epruvetom za uzorke ili prskanjem tekućine.

Čišćenje i održavanje

●Nakon upotrebe, očistite opremu i rotor na vrijeme kako biste održali opremu čistom i izbjegli kontaminaciju ili koroziju.

● Redovno provjeravajte radni status centrifuge kako biste osigurali dugoročnu stabilnost i pouzdanost opreme.

●Praćenjem gore navedenih mjera opreza, možete osigurati sigurnost eksperimentalnih operacija i produžiti vijek trajanja opreme.

Centrifuge su neophodne u mnogim eksperimentima razdvajanja i ekstrakcije ćelija. Strogo pridržavanje radnih specifikacija centrifuge ne samo da može osigurati sigurnost eksperimenta, već i produžiti vijek trajanja opreme i osigurati pouzdanost eksperimentalnih rezultata. Welso je profesionalni dobavljač centrifuga. Više o detaljnim karakteristikama i tehničkim parametrima centrifuga male brzine možete saznati na našoj stranici proizvoda. Također vas pozdravljamo da nas kontaktirate u bilo koje vrijeme kako bismo dobili najprikladniju ponudu.